高效电转化率条件的探索_张建琼

第23卷第2期南京师大学报(自然科学版)V o l.23N o.2 2000年JOU RNAL O F NAN J I N G NORM AL UN I V ER S IT Y(N atural Science)2000

高效电转化率条件的探索

张建琼1,张雪萍1,谢维2,单祥年2,林陵1

(11南京铁道医学院微生物免疫学教研室,南京,210009)

(21南京铁道医学院生物学教研室,南京,210009)

[摘要]　对影响DNA电转化效率的主要因素进行探索.结果表明:在相同的电场强度、电阻和电

容条件下,电脉冲时间的长短对电转化效率有较大影响,电脉冲时间太长或太短均使转化效率降

低;用对数生长早中期的细菌制备感受态细胞,经液氮速冻后储存于-70℃,能获得高转化效率.

[关键词]　大肠杆菌;电转化;转化效率

[中图分类号]R392.11;　[文献标识码]A;　[文章编号]1001-4616(2000)02-0072-04

0　引言

噬菌体抗体库技术已广泛用于许多疾病,尤其是病毒性疾病体液免疫应答的研究,从噬菌体抗体库获得的重组抗体可成为研究、诊断和治疗的有效分子工具.要使目的抗原能从抗体库中筛选出相应的抗体,就得保证抗体库有足够的库容量及库中的抗体片段有足够的多样性,影响这一有效表位多样性的主要因素除了设计优良的PCR引物外,还有细菌的转化效率.目前所用的转化方法首选的是电穿孔法,其转化效率高达1010个转化子 Λg DNA,但如果在培养基中加入抗生素,其转化效率将显著地降低,而氨苄青霉素和四环素是构建抗体库常用的抗菌素.所以目前所报道的抗体库的容量最高为108,平均介于106～107之间[1～3].影响转化效率的因素很多,为了构建优良的噬菌体抗体库,通过优化各个参数,获得高转化效率,为构建高库容量噬菌体抗体库奠定了基础.

1　材料与方法

111　主要仪器

美国B i o2R ad公司电脉冲基因转移仪,美国IEC高速冷冻离心机,美国B eckm an DU270紫外分光光度计.

112　主要试剂及培养基

W izard P lu sM in i p rep s DNA Pu rificati on System为美国P rom ega产品;酵母提取物为英国O xo id产品;蛋白胨为日本制药株式会社产品;四环素、卡那霉素、M O PS为上海生工(Sangon)生物工程公司产品;其余试剂为国产分析纯产品.SOB、SOC、SB培养基自配,无菌10%甘油(用纯水配制).

113　菌株与质粒D NA

大肠杆菌XL12b lue,-70℃保存.pU C18质粒为本室保存,经W izard P lu s M in i p rep s

　收稿日期:1999-09-05

基金项目:江苏省应用基础基金资助(BJ97070)

作者简介:张建琼,女,1960—,博士,南京铁道医学院副教授,从事分子病毒学与免疫学教学与研究.

DNA Pu rificati on K it纯化,以B eckm an DU270紫外分光光度计测定纯度及浓度.

114　电感受态细胞的制备

参考文献[4]并改进.①取-70℃冻存的大肠杆菌XL12b lue接种至SOB2T(含四环素10Λg mL)琼脂平板,37℃培养过夜.从SOB2T琼脂平板上挑取单个菌落接种10mL SB液体培养基(含四环素10Λg mL),37℃恒温水浴摇床,180r m in振荡培养过液.②取上述过夜培养物2mL接种入400mL预热SB(含0.4%葡萄糖,10mm o l L M gC l2),37℃180r m in振荡培养,2h后每隔20m in测1次OD600值,当OD600=0.4时,分取200mL培养物停止培养,另200mL培养到OD600=0.8.③将两种生长时间的培养物转移到200mL无菌离心管,冰浴30 m in,在4℃以4000r m in离心15m in,弃上清液后加入100mL预冷10%甘油重悬沉淀细菌,4℃以4000r m in离心15m in,弃上清重复洗一次.④用25mL预冷10%甘油重悬细菌并转入50mL预冷离心管,3000r m in离心10m in,小心弃上清,留约2～3mL细菌,用滴管小心重悬后分装于无菌Eppendo rf管,每管100ΛL,分别于液氮中速冻5m in存放-70℃冰箱或直接存放-70℃保存.

115　高压电转化及转化效率的测定

按B i o2R ad公司电脉冲基因转移仪说明书操作并改进.取OD600为0.4及0.8,于液氮速冻后或未速冻贮存于-70℃的感受态细胞,放置冰上缓慢解冻,分别加入pU C18质粒DNA 10ng,小心混合后转入预冷电极距离为0.2c m的样品槽,调节电脉冲基因转移仪至电压2.5 kV,电容25ΛF,电阻2008(0hm),用纸巾吸干样品槽的外表面,放入冷电转化池,电脉冲时间分别用信号音响即停、信号音响即停重复2次、信号音响后持续2s1次和信号音响后持续3s1次.电转化后立即用30℃预热SOC2mL洗样品槽转入15mL无菌试管,37℃振荡培养1h.取100ΛL做系列稀释测定转化效率.转化率计数方法:CFU Λg=克隆数(CFU) DNA 量(ng)×稀释度×1000.

2　结果

211　最适电脉冲长度的确定

用OD600为0.4液氮速冻后转入-70℃贮存的感受态细胞,分别加pU C1810ng,用3种不同电脉冲长度电转化后测定转化率结果如表1.

表1　不同电脉冲长度下感受态细胞转化率电脉冲长度转化率

信号音响即停2×105

信号音响即停×21.8×107

信号音响后持续2s3.6×109

信号音响后持续3s6×108表2　不同培养时间和冻存条件的感受态细胞转化率细菌OD600值

转化率

液氮速冻细胞未速冻细胞

0.43.4×1091×109

0.88×1081.2×108

212　感受态细胞最适培养时间及最佳冻存条件的确定

用上述最佳电转化参数,pU C18DNA10ng,分别转化OD600为0.4及0.8,经液氮速冻后及直接-70℃贮存的感受态细胞,计算转化率.结果如表2.

张建琼,等:高效电转化率条件的探索