食源性致病菌检验规范标准操作技巧程序

食源性致病菌检验标准操作程序

福建省疾病预防控制中心

二〇一二年十一月

一、生物样本检验标准操作程序

（一）粪便样本的保存、运送和检测

表1 粪便样本的保存、运送和检测培养条件

培养基目标病原体温度

细菌标本保

存和运送

1. Cary－Blair 所有食源性致病菌室温

增菌液 1. 改良磷酸盐缓冲液小肠结肠炎耶尔森氏菌 4 ℃

2. mEC增菌肉汤EHEC O157:H7/STEC 37 ℃

3. Preston肉汤弯曲菌微需氧42 ℃

4. SBG增菌液沙门氏菌37 ℃

5. 3%氯化钠碱性蛋白胨水弧菌37 ℃

选择性分离平板1. Mac平板EPEC、STEC、ETEC、EIEC、

EAEC、志贺氏菌

37 ℃

2. XLD平板志贺氏菌37 ℃

3. mCCD平板弯曲菌微需氧42 ℃

4. 耶尔森氏菌选择性平板小肠结肠炎耶尔森氏菌25 ℃

5. 科玛嘉O157:H7显色平板EHEC O157:H7 37 ℃

6. 科玛嘉沙门氏菌显色平板沙门氏菌37 ℃

7. 科玛嘉弧菌显色平板

TCBS平板

弧菌37 ℃

病毒标本 1. 采便盒轮状病毒、诺如病毒、札如

病毒、星状病毒、腺病毒

-20 ℃以下

\\ （二）检验方法与流程

（三）沙门氏菌和志贺氏菌检测操作程序

1 范围

本程序规定了粪便标本中沙门氏菌（Salmonella）和志贺氏菌（Shigella）的检验方法。

2 检验程序

沙门氏菌和志贺氏菌检验程序见图1。

图1 沙门氏菌和志贺氏菌检验程序

3 操作步骤

3.1 标本收集

标本包括新鲜的或转移至Cary-Blair运送培养基的粪便或肛拭子。最优标本是转移至Cary-Blair运送培养基的粪便拭子。肛拭子不是最佳标本，仅在病人无粪便标本时采用。肛拭子收集后应当目测，需要在拭子上明显见到粪便。

所采集的标本尽快检验，放入Cary-Blair运送培养基中的标本应在冷藏条件下24 h内送检。新鲜的粪便标本置于清洁、干燥、无肥皂或消毒液残留的容器中，冷藏条件下8 h 内送检。

3.2 分离培养

3.2.1 直接分离培养

新鲜粪便：无菌拭子采集少量粪便，尽量从可见血或黏液的部位收集；新鲜拭子在XLD 和MAC一区划线；以1 µL无菌接种环或接种针划线分离。在标本中再插入一个清洁的无菌拭子，将拭子放入SBG增菌液。轻拧管盖。注意：拭子表面有一层标本即可，不可将过量的标本放入SBG增菌液。

肛拭子：操作程序同新鲜粪便。

转移至Cary-Blair运送培养基的粪便拭子：轻搅混合标本；拭子在XLD和MAC一区划线；以1 µL无菌接种环或接种针划线分离；在标本中再插入一个清洁的无菌拭子，将拭子放入SBG增菌液。轻拧管盖。注意：拭子表面有一层标本即可，不可将过量的标本放入SBG增菌液。

平板36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。

3.2.2 增菌培养

增菌液于36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h，采用上述方法于科玛嘉沙门氏菌显色平板上划线分离，36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。

3.3 菌落特征

3.3.1 选择性平板上可疑菌落的特征见表1。

表1沙门氏菌属和志贺氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征

选择性琼脂平板

沙门氏菌

（大多数）

伤寒沙门氏菌志贺氏菌属

MAC琼脂菌落光滑、无色，直

径2 mm～3 mm XLD琼脂菌落呈红色，直径2

mm～4 mm

科玛嘉显

色培养基

紫色或酒红色紫色或酒红色

3.4 纯培养

挑取3个或以上可疑菌落，划线接种5%羊血琼脂平板，36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。

3.5 初步鉴定

可疑菌落接种TSI琼脂，赖氨酸脱羧酶培养基、动力-靛基质-鸟氨酸琼脂（MIO）、西

蒙氏柠檬酸盐琼脂和尿素琼脂。沙门氏菌属和志贺氏菌属生化反应初步鉴别见表2。

表2沙门氏菌属和志贺氏菌属生化反应初步鉴别表

3.6 血清学鉴定

挑取5%羊血琼脂平板上的菌落，进行沙门氏菌和志贺氏菌的血清学鉴定，设盐水对照。

3.7 确定鉴定

刮取5%羊血琼脂平板上的单个菌落，进行系统生化鉴定。

4 结果与报告

报告粪便标本中检出沙门氏菌或志贺氏菌。

5 菌株的保存和上送

培养物穿刺接种半固体培养基，轻拧管盖，36 ℃±1 ℃培养24 h，盖紧管盖。如果需要长期保存菌株，将0.7 mL 脑心浸液肉汤6 h～12 h培养物和0.3 mL 灭菌甘油加入灭菌菌种管，立即放置－70 °C保存。按照方案要求定期上送。

（四）致泻大肠埃希氏菌检测操作程序

1 范围

本程序规定了粪便标本中致泻大肠埃希氏菌（Diarrheagenic Escherichia coli）的检验方法。

2 操作步骤

2.1 标本收集

标本包括新鲜的或转移至Cary-Blair运送培养基的粪便或肛拭子。最优标本是转移至Cary-Blair运送培养基的粪便拭子。肛拭子不是最佳标本，仅在病人无粪便标本时采用。肛拭子收集后应当目测，需要在拭子上明显见到粪便。

所采集的标本尽快检验，放入Cary-Blair运送培养基中的标本应在冷藏条件下24 h内送检。新鲜的粪便标本置于清洁、干燥、无肥皂或消毒液残留的容器中，冷藏条件下8 h 内送检。

2.2 直接分离培养

新鲜粪便：无菌拭子采集少量粪便，尽量从可见血或黏液的部位收集；新鲜拭子在MAC 一区划线；以1 µL无菌接种环或接种针划线分离。

肛拭子：操作程序同新鲜粪便。

转移至Cary-Blair运送培养基的粪便拭子：轻搅混合标本；拭子在MAC一区划线；以1 µL无菌接种环或接种针划线分离。

平板36 ℃ 1 ℃培养18 h～24 h。

2.3 菌落特征

挑取5个可疑大肠埃希氏菌菌落（粉红色、突起、光滑、湿润）直接保存半固体菌种管；采用PCR检测特异毒力基因方法鉴别5种致泻大肠埃希氏菌。

3 多重PCR鉴定

3.1 标准菌株

标准菌株一览表见表3。

表3标准菌株一览表

菌株名称标准号来源

EPEC CMCC 44155 中国食品药品检定研究院

STEC 具有stx1、stx2毒力基因中国疾病预防控制中心传染病所ETEC CMCC 44815 中国食品药品检定研究院

EIEC CMCC 44825 中国食品药品检定研究院

EAEC 042血清型中国疾病预防控制中心传染病所大肠埃希氏菌ATCC 25922 WHO

3.2 引物合成

多重PCR引物序列见表4。