黑米中花青素的提取

黑米中花青素的粗提取
摘要：本课题以黑米为原料，采用水提法和酸化乙醇提取法对黑米中的花青素进行粗提取。

采用单因素试验考察了料液比、提取时间、提取温度、pH值及提取液浓度对花青素提取量的影响。

在此基础上，通过正交试验考察花青素的最佳提取工艺。

关键词：黑米；花青素
前言
化学合成的食用色素具有色泽鲜艳、稳定性好、成本低廉、制备简单等优点，在食品工业中得到广泛应用。

随着人们回归自然的意识日益增强，促使人类重新认识到天然色素作为食品添加剂具有不可代替的价值。

天然色素直接取自于自然界中的动植物和微生物，因而用于食品、化妆品及至药品更为安全可靠。

我国食品行业对合成色素与天然色素都有使用［１］。

但现代医学研究表明：合成色素作为食品着色剂可造成人体伤害。

因此，许多发达国家禁止在食品中使用合成色素，天然色素来源于自然，具有安全性，有的还有一定的营养和药理作用［２］。

开发天然色素取代人工合成色素作为食品着色剂是必然的发展趋势。

黑米是特种稻米，营养丰富，具有一定的保健作用，被认为是滋补佳品，有“开胃益中，健脾暖肝，明目活血，滑涩补精”等作用，历来深受东亚地区人民的喜爱。

研究证实，黑米所表现出来生理保健作用主要不是来自黑米中的膳食纤维、维生素和矿物质等营养素，而是与黑米皮中富含的花色苷色素有关［３］。

花色苷是自然界广泛分布的一种植物多酚，在大部分植物花瓣和果实种皮当中都不同程度的存在。

黑米成熟过程中，会在种皮内积聚大量花色苷色素，从而使其糙米呈现出棕红色、紫红色、紫黑色乃至黑色等颜色。

近年来的研究发现，花色苷类物质除了赋予植物丰富的色彩外，还具有抗氧化、抗炎、降血脂以及抑制肿瘤生成等生理功能，同时花色苷作为一种较为安全的天然色素，在食品工业也显示出了广阔的应用前景［４］，因而研究和开发利用黑米色素有良好的发展前景。

花青素分子中因存在高度分子共轭体系，易溶于水、甲醇、乙醇等极性溶剂中，因此通常以含有少量盐酸或甲酸的乙醇为溶剂提取花青素。

其提取方法主要有溶剂提取法、超声提取法、微波提取法、超临界流体萃取法等。

溶剂提取法中
水提法成本低，但提取率差，资源浪费严重；超临界流体萃取法对设备要求较高，成本高；超声提取法的生产能力不高，不适合大规模生产［５－７］。

本实验采用水提法和酸化乙醇提取法对黑米中花青素的提取工艺进行研究，旨在确定黑米中花青素的最佳提取工艺，为黑米资源的充分利用奠定理论基础。

1材料
1.1供试材料
黑米购自石河子市金马粮油店
1.2主要仪器设备
紫外－可见分光光度计、电子天平、恒温水浴锅、离心机、旋转蒸发仪、冷冻干燥机、粉碎机、恒温培养箱、真空泵、布氏漏斗、抽滤瓶、容量瓶、三角瓶、烧杯、试管、量筒、玻璃棒、移液管、滤纸等。

1.3主要试剂
75%乙醇、无水乙醇、磷酸氢二钠、盐酸、柠檬酸
2方法
2.1标准曲线的制作
（1）配制浓度为0.31mg/ml的花青素标准液
准确称取1.24mg花青素标样，溶于4ml无水乙醇，摇匀，制得应用液。

（2）分别精密移取上述标准应用液0、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00ml 至10.00ml容量瓶中，用75%乙醇溶液准确定容，得到浓度分别为0、3.10、6.20、12.40、18.60、24.80、31.00μg/ml的标准系列溶液［８］。

以75%乙醇溶液为空白对照，在530nm波长下测定上述标准系列溶液的吸光度，绘制吸光度－浓度标准曲线(图1)，并计算出回归方程。

2.2水提法提取黑米花青素
操作要点
（1）原料选择及处理。

先将黑米中的杂质去除，再用高效粉碎机粉碎，然后过60目筛，得黑米粉末。

（2）提取。

分别将黑米粉搅拌均匀，在不同的提取温度、时间、料液比、pH下进行提取。

（3）抽滤。

用布氏漏斗、抽滤瓶和真空泵将反应好的料液抽滤。

（4）蒸发浓缩。

用旋转蒸发仪将滤液蒸发浓缩后备用。

（5）干燥。

先将浓缩后的滤液置于平皿中先冻成冰，再置于冷冻干燥机内干燥得花青素的粗提取物。

2.2.1单因素试验
2.2.1.1料液比对花青素提取率的影响
精确称取5份3.0g的黑米粉，放入锥形瓶中，按料液比(W/V)1：4、1：6、1：8、1：10、1：12的比例分别加入纯净水，常温提取120min。

抽滤后将滤液定容至250ml，并在波长为530nm处测其吸光度值。

2.2.1.2提取温度对花青素提取率的影响
精确称取5份3.0g的黑米粉，放入锥形瓶中，按料液比(W/V)1：10加入纯净水，然后将锥形瓶分别放入30、40、50、60及70℃的水浴锅中，保温提取120min，抽滤后将滤液定容至250ml，并在波长530nm处测其吸光度值。

2.2.1.3提取时间对花青素提取率的影响
精确称取5份3.0g的黑米粉，放入锥形瓶中，按料液比(W/V)1：10加入纯净水，然后将锥形瓶放入50℃的水浴锅中，分别提取80、100、120、140及160min，抽滤后将滤液定容至250ml，并在波长530nm处测其吸光度值。

2.2.1.4pH对花青素提取率的影响
精确称取5份5.0g的黑米粉，放入锥形瓶中，按料液比(W/V)1：10加入pH 分别为2.8、3.2、3.6、4.0、4.4的磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液，将锥形瓶放入50℃水浴锅中，保温提取120min，抽滤后将滤液定容至250ml，并在波长530nm处测其吸光度值。

2.2.2正交试验
表1水提法提取黑米花青素的正交试验因素与水平
水平
因素
料液比（A）温度(B) pH(C) 时间(D)
1 1:8 40 2.8 100
2 1:10 50 3.2 120
3 1:12 60 3.6 140
从黑米中提取花色苷属于固液浸提过程，由于该过程受到溶剂、温度、时间、物料比等多种因素的影响，优化其最佳的因素与水平是提高黑米花色苷提取率的
黑米中花青素提取率的影响。

进行正交试验L9(34)(表1)，以提取液的吸光度值为评价指标，确定水提法提取黑米花青素的最佳提取工艺［９］。

2.3酸化乙醇提取法提取黑米花青素
由于黑米花青素属水溶性色素，在中性或弱碱性溶液中不易被提取且不太稳定。

酸性溶剂可在破坏植物细胞膜的同时溶解花青素，故采用酸化乙醇浸提法提取黑米花青素。

先将黑米中的杂质去除,再用高效粉碎机粉碎，然后过60目筛，得黑米粉末。

分别将黑米粉搅拌均匀，在不同的提取温度、提取时间、料液比、提取液浓度下进行提取，离心(5000r/min)15min，取上清液1ml，先定容至10ml后在530nm测定吸光值。

2.3.1单因素试验
2.3.1.1提取液浓度对花青素提取量的影响
分别称取黑米粉五份，每份1.00g，分别添加55％、65％、75％、85％、95％的乙醇溶液10ml在30℃水浴中提取30min，提取1次，将提取液离心，取上层清液1ml，定容至10ml后在530nm测吸光值。

2.3.1.2提取时间对花青素提取量的影响
分别称取黑米粉五份，每份1.00g，用10ml75％乙醇溶液在30℃水浴中提取20、30、40、60、80min，提取1次，将提取液离心，取上清液1ml，定容至10ml 后在530nm测吸光值。

2.3.1.3提取温度对花青素提取量的影响
分别称取黑米粉五份，每份1.00g，用10ml75％乙醇溶液在20、30、40、50、60℃的水浴中提取30min，提取1次，将提取液离心，取上清液1ml后定容至10ml在530nm处测吸光值。

2.3.1.4提取液的料液比对花青素提取量的影响
分别称取黑米粉五份，每份1.00g，按料液比1：4、1：6、1：8、1：10、1：12的料液比加入75％乙醇在30℃水浴中提取30min，提取1次，将提取液离心，取上清液1ml定容至10ml在530nm处测吸光值。

2.3.2正交试验
黑米中花青素提取率的影响。

进行L9（34）正交试验(表2)，以提取液的吸光度值为评价指标，确定酸法提取黑米花青素的最佳提取工艺［１０］。

表2酸化乙醇法提取黑米花青素的正交试验因素与水平
因素
水平
乙醇浓度（A）温度（B）时间（C）料液比（D）
1 65 20 30 1:6
2 75 30 20 1:8
3 85 40 40 1:10
3结果与分析
3.1标准曲线的确定
计算得线性回归方程为A=0.0007+0.0318C(A为530nm处吸光度，C为原花青素质量浓度，单位μg/ml），相关系数R=0.9985），见图1。

图1花青素标准曲线
3.2水提法—单因素与正交试验结果
3.2.1料液比
料液比（g/ml）实际上是固体物料与溶剂用量的比值。

一般来说，料液比越小，花青素的提取率越大。

从图2可看出，随着料液比的降低，花青素的含量总趋势是增加的。

当料液比达到1：10时，吸光值最大，说明花青素的浓度达到最大。

当继续降低固液比时，提取量反而下降，分析原因可能是，当固液比降低到一定程度时，原料内部与溶剂之间溶质已经达到平衡，反而使杂质溶解增加，相应减少花色苷的提取量。

花青素的浓度变小，反而不利于花青素的提取。

故初步
确定料液比为1：10时的提取效果最好。

图2 水提法料液比对花青素提取率的影响
3.2.2 提取温度
从图3可以看出，随着提取温度的升高，花青素得率呈先上升后下降的趋势。

随着温度升高溶，剂分子运动速度加快，从而使其渗透、扩散、溶解速度加快。

另一方面，高温也使细胞膜流动性增强，有利于花青素从细胞内转移到提取溶剂中。

但是，温度过高，黑米色素中的花色苷物质耐热性较差极易氧化［１１］，从而使花青素浓度下降。

花青素有效成分的结构被破坏的程度越大，其色素的结构发生变化易褪色，从而对黑米色素的色价及稳定性有一定影响，活性成分损失就越多。

并且高温下固体原料本身会起化学变化，使杂质过多。

高温提取也会增加能源消耗，故在高温下提取不利于色素的纯度和质量。

因此选择50℃时为最适宜的浸提温度。

故初步确定提取温度为50℃时的提取效果最好。

图3 水提法提取温度对花青素提取率的影响
3.2.3 提取时间
0.05
0.10.150.20.25
0.30.351:4
1:6
1:8
1:10
1:12
料液比（W/V）
吸光
值
0.00
0.050.100.150.200.25
0.300.3530℃
40℃
50℃
60℃
70℃
温度（℃）
吸光值
从图4可看出，随着提取时间的延长，花青素的得率先逐渐增加，当提取时间达120min 时，花青素的溶解度达到最大，提取率最高。

后随着提取时间的进一步延长，花青素变得不稳定，颜色发生变化，使得吸光度先略有上升，然后逐渐减小。

故初步确定提取时间为120min 时的提取效果最好。

图4 水提法提取时间对花青素提取率的影响
3.2.4 pH
花青素在水溶液中以黄盐阳离子、醌型碱、假碱、查耳酮形式存在，这四种形式随水溶液的pH 变化而发生可逆改变，同时，溶液的颜色也随结构改变而改变。

当溶液的pH ＜2时，花青素以黄盐阳离子形式存在，溶液显红色。

当pH 逐渐升高时，花青素失去C 环氧上的阳离子变成蓝色醌型碱。

醌型碱在酸性溶液中与黄盐阳离子之间可逆转化。

随着溶液pH 进一步升高，醌型碱转变为假碱，此时花青素的溶液呈无色，假碱与查耳酮也可逆转化［１２］。

文献报道，酸化水溶液对黑米中的花色苷类物质也具有相当好的萃取能力，增加重结晶程序可以提高色素的纯度[13]。

从图5可以看出，随着提取液pH 的增大，花青素的得率先略有上升，而后逐渐减小，花青素得率反而有所下降，可能是过高浓度的酸引起花青素糖苷键断裂所致。

其主要是因为酸可抑制酚类物质与金属离子的沉淀反应，同时抑制酚羟基的自竭力，增强了溶剂破坏结合键的能力，破坏酚类物质与蛋白质、多糖、及自身之间的氢键和疏水键作用，从而提高原花青素的溶出量。

但过度酸化，会造成原花青素溶解性能减小，提取率反而下降。

故初步确定提取液的最佳pH 为3.2。

0.05
0.10.150.2
0.2580
100
120
140
160
时间（min）
吸光值
图5 水提法pH 对花青素提取率的影响
3.2.5 正交试验结果
表3 水提法提取工艺的正交试验结果
实验号 因素
吸光值 A B C D 1 1 1 1 1 0.1953 2 1 2 2 2 0.3368 3 1 3 3 3 0.0869 4 2 1 2 3 0.2212 5 2 2 3 1 0.1811 6 3 3 1 2 0.223 7 3 1 3 2 0.1653 8 3 2 1 3 0.278 9
3 3 2 1 0.218 K 1 0.2063 0.1939 0.2321 0.1749 K 2 0.208
4 0.2653 0.2563 0.2417 K 3 0.218 0.173
5 0.1444 0.1953 R
0.0117
0.0918
0.1119
0.0668
从表3可看出，4个因素对黑米花青素的提取率的影响大小依次为C ＞B ＞D ＞A ，即pH ﹥提取温度﹥提取时间﹥料液比，其中pH 对提取率的影响显著；4因素的最优组合为A 3B 2C 2D 2，即当料液比为1：12，提取温度50℃，pH 为3.2，提取时间为120min 时，花青素提取效果最好。

经验证试验，该条件下的提取液吸光值与料液比为1：8，而其他条件一致下的提取液的吸光值相差不大。

因此，从节省成本的角度考虑，试验最终确定黑米花青素的最佳提取工艺为料液比1：8，提取温度50℃，pH3.2，提取时间120min 。

正交试验花青素吸光值在0.0869—0.3368之间，其中提取率最高的是2号实验，其吸光值为0.3368。

在A 3B 2C 2D 2
工艺条件下进行花青素提取实验后发现，
00.10.20.30.40.5
0.62.8
3.2
3.64
4.4
PH
吸光值
黑米花青素的吸光值为0.3640，可见，黑米花青素提取率有略微提高。

与2号正交试验（A 1B 2C 2D 2）相比，吸光值提高主要原因是料液比曾大，从而增大了花青素的溶解量，致使细胞内花青素迅速并完全释放出来。

因此，取A 3B 2C 2D 2为提取黑米花青素最佳工艺条件。

3.3 酸化乙醇法—单因素与正交试验结果 3.3.1 提取剂的浓度
从图6可知，随乙醇浓度的升高，花青素的提取量也逐渐增加，但当乙醇浓度达75%后，随乙醇浓度的升高花青素的提取量逐渐减少，这可能是因为乙醇体积分数继续增加时，一些醇溶性杂质、亲脂性强的成分溶出量增加，这些成分与花青素竞争与乙醇－水分子结合，从而导致原花青素的提取效果下降。

其次因为水起着穿透植物细胞的作用，没有水存在就无法将有效成分溶出，但另一方面，自由水的大量存在必然会使水溶性杂质增多［１４］。

故应选择75%的乙醇溶液作为花青素的提取剂。

图6 酸法提取提取液浓度对花青素提取量的影响
3.3.2 提取时间
从图7可知，随着提取时间的延长，提取率不断提高，30min 提取率最高，然后提取率平稳下降。

当20－30mim 时，浸提时间越长，黑米花青素的吸光值越大，此时，黑米粉细胞内外有效成分浓度达到平衡，提取效果最好。

随着时间的进一步延长，浓度反而逐步下降。

分析原因可知，这是因为溶出的花青素不稳定，浸提时间太长而使体系温度过高从而造成了色素的破坏，部分被氧化分解破坏掉了，并增加了生产成本。

但是，短时提取无法使原花青素很快从果皮肉细胞中溶出，故选择30mim 为最佳浸提时间。

0.34
0.350.360.370.380.39
0.455%
65%
75%
85%
95%
乙醇浓度
吸光值
图7 酸法提取时间对花青素提取量的影响
3.3.3 提取温度
从图8可以看出，30℃提取率最高，随着温度的升高，提取率有所下降。

30℃提取效果最佳。

在一定阶段内，随着温度的升高提取效果也在不断变优异，这是因为温度升高，使植物组织软化、膨胀，从而增加可溶性物质的溶解度和扩散速度，利于有效成分浸出。

但如果继续升温，提取效果反而降低。

因为虽然升温有利于色素的溶出，但花青素的稳定性较差，温度升高，花青素会发生氧化、聚合，导致提取率下降，使热不稳定成分或挥发性成分分解、变质或挥发，特别是接近乙醇的沸点(78.5℃）时，乙醇易挥发。

温度低时，花青素与蛋白质、纤维等分离较慢，也会导致提取率下降。

故选择30℃为最佳浸提温度。

图8 酸法提取温度对花青素提取量的影响
3.3.4 提取料液比
从图9可知，随着料液比的增大，吸光度在提高。

这表明，提取溶剂量大时，细胞膜在短时间内急剧膨胀破裂，花青素被迅速萃取进入溶剂。

而料液比较小时，一方面无法使原料达到有效浸泡；另一方面溶剂中的花青素也极易达到饱和，
从
0.355
0.360.3650.370.3750.380.3850.390.3950.420
30
40
60
80
时间（min）
吸光
值
0.3
0.320.340.360.38
0.420
30
40
50
60
温度（℃）
吸光值
而抑制其进一步溶出。

当料液比为1:10时，提取液中花青素吸光值达到最大，花青素几乎被最大限度提取出来了。

但料液比到达1：10时与1：8时的提取率没有显著差异。

综合考虑成本及后续浓缩处理，该试验选择了1：8的料液比。

继续增大料液比，提取率增加不大，同时还会增加成本，也使提取液的浓缩工作负荷增加。

0.33
0.340.350.360.370.380.391:4
1:6
1:8
1:10
1:12
料液比（W/V）
吸光值
图9 酸法提取料液比对花青素提取量的影响
3.3.5 正交实验结果
表4 酸法提取工艺的正交试验结果
实验号 吸光值 A B C D 1 1 1 1 1 0.3821 2 1 2 2 2 0.3912 3 1 3 3 3 0.3753 4 2 1 3 2 0.3942 5 2 2 2 3 0.3956 6 3 3 1 1 0.3883 7 3 1 2 3 0.3813 8 3 2 3 1 0.3942 9 3 3 1 2 0.385 K 1 0.3829 0.3859 0.3876 0.3882 K 2 0.3927 0.3937 0.3869 0.3901 K 3 0.3868 0.3829 0.3875 0.3841 R
0.0098
0.0108
0.0007
0.006
通过正交试验，结果表明(表4)，影响黑米花色素提取率的因素主次顺序为：B ＞A ＞D ＞C ，即提取温度对黑米花色素苷提取效果影响最大，其次为乙醇浓度和料液比，提取时间影响较小。

即酸化乙醇法提取黑米花青素的最优组合为
A2B2C1D2，即最佳提取条件：乙醇浓度为75％，浸提温度为30ºC，料液比为1：8，浸提时间为30min。

正交试验花青素吸光值在0.3753—0.3956之间，其中提取率最高的是5号实验，其吸光值为0.3956。

在A2B2C1D2工艺条件下进行花青素提取实验后发现，黑米花青素的吸光值为0.4267，可见，黑米花青素提取率有略微提高。

与5号正交试验（A2B2C2D3）相比，吸光值提高主要原因是提取时间加长，料液比减小，从而使黑米花青素尽可能释放出来。

因此，取A2B2C1D2为提取黑米花青素最佳工艺条件。

3.4黑米花青素粗提取得率计算
根据花青素标准曲线得线性回归方程为A=0.0007+0.0318C
3.4.1水提法
准确称取黑米粉5.00g，将黑米粉搅拌均匀，按料液比为1：8，提取温度为50ºC，pH为3.2，浸提120min后过滤，所得滤液定容之至500ml,在530nm处测吸光值为：0.3640。

后将滤液经旋转蒸发仪浓缩，后冷冻干燥，得花青素粗提取物1.21g。

花青素得率的计算：
线性回归方程为A=0.0007+0.0318C
即0.3640=0.0007+0.0318C
故得C=11.42
3.4.2酸化乙醇提取方法
准确称取黑米粉1.00g，将黑米粉搅拌均匀，按料液比为1：8加入75％的酸化乙醇，提取温度为30ºC，浸提30min后将提取液离心，去上清液1ml定容至10ml，在530nm处混匀测吸光值为：0.3961。

花青素得率的计算：
线性回归方程为A=0.0007+0.0318C
即0.4267=0.0007+0.0318C
故得C=13.40
4结论与讨论
本课题采用了溶剂浸提法浸提黑米中的花青素，即水提法和酸化乙醇浸提
法。

水提法和酸性乙醇浸提法均是提取色素最常用的一种方法，其方便、快捷、简单。

利用水提法提取黑米花青素的实验中，在单因素试验的基础上，利用张文佳等的实验确定了影响原花青素得率较显著因子，即料液比、提取温度，提取时间和pH值。

通过正交实验确定最优工艺，即最终确定黑米花青素的最佳提取工艺为料液比1：8，提取温度50℃，pH3.2，提取时间120min。

此条件下测得的花青素的吸光值为0.3540，根据回归方程得黑米花青素的粗提取率为11.42。

利用酸化乙醇浸提法提取黑米花青素的实验中，在单因素试验的基础上，利用赵权等的实验确定了影响原花青素得率较显著因子，即料液比、提取温度，提取时间和乙醇浓度。

通过正交实验确定最优工艺，即最佳提取条件：乙醇浓度为75％，浸提温度为30ºC，料液比为1：8，浸提时间为30min。

此条件下测得的花青素的吸光值为0.4267，根据回归方程得黑米花青素的粗提取率为13.40。

综上所述，黑米花色苷作为一种天然食用色素，安全无毒、色彩鲜艳且资源丰富，同时具有广泛的疾病预防和健康促进作用，在食品和医药领域具有较大的应用潜力。

目前对黑米花青素的研究仍然处于起步阶段，黑米花青素的浸提工艺还未完善［１５］。

而本研究采用了绿色、低碳的分离纯化工艺，所制得的黑米花青素粗提取物，为黑米的加工及花青素的规模化生产提供了依据。

今后的研究方向因从黑米花青素的浸提工艺的研究入手，为开发利用丰富的黑米资源，增加经济附加值，寻找天然食品着色剂提供依据。

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