干细胞的体外培养概述

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干细胞几个主要特征
干细胞的自我更新与分化需要特定的微环境,也就是说 干细胞往哪一种方向分化,必须在该细胞生存的特定微 环境前提下进行分化。已有诸多的实验表明,如将ES细 胞种植入小鼠大脑内,这些干细胞将向神经系统分化。
在不同生长因子刺 激下干细胞可表现 出不同分化潜能
干细胞几个主要特征
干细胞分裂产生的子细胞只能有两种命运——保持 为干细胞或分化为特定细胞。
干细胞几个主要特征
具有自我更新能力与自我维持能力,可以无限增 殖分裂。干细胞一旦形成,在机体内终生都具有 自我更新能力,以维持自身数目的恒定。 既具有生理性的更新能力,也具有对损伤或疾病 导致的反应有修复能力,如骨髓间充质干细胞等。
干细胞维持自稳性的机制:对称分裂和不对称分裂
干细胞的对称分裂和不对称分裂
至今已分离得到的胚胎干细胞物种有:



小鼠的胚胎干细胞(1981) 金黄地鼠(1988)、貂(1993)、猪 (1994,1997)、鸡(1996)、恒河猴 (1995)、绒猴(1996)。 分离得到人的胚胎干细胞(1998),胚胎生 殖细胞(1998), 目前不断报道成年组织来源的的干细胞。
MEF和STO的优缺点:
MEF分泌促进胚胎干细胞增殖和抑制分化因子的能力比 STO强,STO作饲养细胞时常需在培养基中加入LIF。 MEF不能长期传代,需经常准备怀孕小鼠制备第三代至 第五代细胞,STO则可长期传代培养。 MEF不具耐药性,不能作为转染外源性基因的胚胎干细 胞筛选用。 SNL细胞为转染了neor抗性基因和LIF基因的STO细胞, 可分泌足够的抑制分化因子,并因带有neor抗性基因可 用于转基因胚胎干细胞筛选。 胚胎干细胞培养过程中,死亡MEF或STO的染色体可能 导致胚胎干细胞的突变及影响正常核型的保持。 不易获得纯的胚胎干细胞作为生化和分子生物学方面的分 析。 使用前如用丝裂霉素C处理,如清洗不彻底,残余的丝裂 霉素C会影响胚胎干细胞的增殖。
2、根据来源来分:
来源于胚胎--- 胚胎干细胞 ESC
(Embryonic Stem Cell )
胚胎性生殖细胞 EGC
(Embryonic Germ Cell )
来源于成体组织--- 成体干细胞 ASC (Adult-derived Stem Cell )
胚胎干细胞
指从着床前的胚胎内细胞团(桑椹胚)或原始 生殖细胞获得的一种具有多潜能性、可发育成 为各种细胞、同时可保持不分化状态而持续生 长的克隆细胞系。
报道的人源性滋养层细胞:



人骨髓来源的间充质干细胞 胎儿肌肉或胎儿皮肤细胞 新生儿包皮成纤维细胞 成人子宫内膜细胞 人胎盘成纤维细胞 人胚胎干细胞经体内分化获取的间充质 干细胞
2、饲养单层制备
MEF 或 STO 连成一片,以含 10μg/ml 丝裂霉素培养液 370C 作 用 2-3 h(如细胞层较薄,也可缩短至 30min-1.5h),或 γ 射线照射(剂量为30-100Gy)。 弃含丝裂霉素培养液,PBS洗5次, γ 射线处理者不用清洗。 消化细胞,制备悬液种植至用 0.1% 明胶处理过( 0.1% 明胶水 溶液覆盖培养瓶表面,室温 2h以上)的培养瓶,种植细胞 数:MEF7.5×104-105个/cm2,STO为5×104个/cm2。
人胚胎干细胞来源
a.自终止妊娠(5-9周人工流产)的胎儿中提取生 殖母细胞( primordial germ cell )。
Gearhart法
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b.取自体外受精胚胎囊胚期内层细胞。用这种 方法,每个胚胎可取得15-20个细胞用于培 养。
Thomson 法
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c.通过体细胞核转移技术(SCNT技术)获取
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其它干细胞的分离与纯化


干细胞表面有许多特殊的标记,以造血系统 为例,干细胞的表面标志有Sca-1和c-kit等。 另外各种成体干细胞还有各自独特的标记物, 如人造血干细胞表现为CD34+和Thy10+而CD10, CD14,CD15,CD16,CD19,CD20皆为阴性 另外干细胞还有不同于一般分化细胞的物理 特性,比如干细胞不被染料Hoechst33324和 Rhodamine123染色。利用这些特性及表面标 志,采用荧光细胞分离器从单细胞悬液中即 可分离纯化干细胞。
它可以无限增殖并分化成为全身200多种细胞类型,
进一步形成机体的所有组织、器官。为全能干细胞。
成体干细胞
是成体组织内具有自我更新及分化一种或一种 以上子细胞的未成熟细胞。 来源于成年组织或器官,一般具有组织特异性, 只能分化成特定的细胞或组织。为多能干细胞 或单能干细胞,如造血干细胞和上皮干细胞等。



1981年,从小鼠胚泡内细胞团分离出小鼠ES细胞, 并建立了小鼠ES细胞体外培养条件。将ES细胞注入小 鼠,能诱导形成畸胎瘤。 1984-1988年,Anderews 等人从人睾丸畸胎瘤细 胞系Tera-2中产生出多能的、可鉴定的(克隆化的) 细胞,称之为胚胎癌细胞(embryonic carcinoma cells, EC细胞)。克隆的人EC细胞在视黄酸的作用下 分化形成神经元样细胞和其他类型的细胞。 1989年,Pera 等分离了一个人EC细胞系,此细胞系 能产生出三个胚层的组织。这些细胞是非整倍体的 (比正常细胞染色体多或少),他们在体外的分化潜 能是有限的。
3、用于培养胚胎干细胞的条件培养基
直接在胚胎干细胞培养液中加入重组的LIF,使 终浓度为1000U/ml。 Baffalo大鼠肝细胞株BRL条件培养基(BRLCM):能分泌抑制畸胎癌(瘤)和胚胎干细胞分 化的因子DIF。收集培养72h的培养液,过滤除 菌,用前6-7份+3-4份胚胎干细胞培养液,再 添加8-10%胎牛血清。 年龄 2-3周大鼠心肌细胞条件培养基(RHCM):分泌抑制胚胎干细胞分化因子。收集16代细胞培养液,过滤除菌,用前6份+3份胚胎 干细胞培养液+1份胎牛血清。




1998年美国有两个小组分别培养出了人的多能干细胞: James A. Thomson在 Wisconsin大学领导的研究小组的 方法是:人卵体外受精后,将胚胎培育到囊胚阶段,提取 inner cell mass细胞,建立细胞株。 John D. Gearhart 在 Johns Hopkins大学领导的另一个研究小组的方法是: 从受精后5-9周人工流产的胚胎中提取生殖母细胞 ( primordial germ cell ),建立细胞株。 1999年12月,美国科学家在《美国科学院院刊》报告说, 小鼠肌肉组织的成体干细胞可以“横向分化”为血液细胞。 随后,世界各国的科学家相继证实,成体干细胞,包括人 类的成体干细胞具有可塑性。 1999年12月,干细胞研究进展被《科学》杂志评选为该 年度世界十大科学进展之首。 2007年日本的Yamanaka研究小组和美国的James Thomson 研究小组分别获得诱导多能性干细胞 (induced pluripotent stem cell,iPS细胞)。
血清缺点: 成分复杂,不利于整合到胚胎干细胞基因组中外 源性基因功能的测定; 可能含有一些未知的促进胚胎干细胞分化的因子; 含有微量的血红蛋白和内毒素,干扰胚胎干细胞 生长。 无血清胚胎干细胞培养液无上述缺点,但细胞贴 附力不如有血清培养基。
(2)胚胎干细胞的分离
小鼠:
母小鼠超数排卵交配(注射孕马血清促性腺激素和人绒毛 膜促性腺激素)
4、胚胎干细胞的分离和培养
(1)培养液
配制培养液要用超纯水或五蒸水,不能有细菌内毒素 污染,水要现用现制。
高糖DMEM作为基础培养基,葡萄糖浓度为 (4.5g/L):有助于囊胚贴壁、内细胞团增殖及胚胎 干细胞集落形成。
使用前还要添加β-巯基乙醇(0.1mmol/L)或单硫甘 油( 0.15mmol/L):保护细胞内酶和蛋白质中的巯 基不被氧化,促进胚胎干细胞的贴壁和克隆形成。 使用前要添加15%胎牛血清:必不可少,但也有缺点。
(二)基本过程
胚胎的制备和培养 饲养层细胞制备或 条件培养基制备 胚胎干细胞的分离
胚胎干细胞的培养 胚胎干细胞的鉴定
冻存与复苏
细胞克 隆形态
碱性磷酸 酶检测
核型的 鉴定
分化能力 的观察
嵌合能力 的测定
1、饲养层细胞培养


小鼠胚胎成纤维细胞( MEF):取孕12.514.5 d鼠胚胎躯干,以植块培养法或分散细胞 培养法制备,取第三代至第五代细胞作为饲养 层细胞。 STO细胞:按照一般已建细胞系培养方法。 DMEM加10%小牛血清作为培养液。 采用胎数多小鼠一次大量培养MEF冻存,用时 复苏。
四、胚胎干细胞的体外培养
(一)技术原理
基本原则:促进ES增殖的同时,维持其未分化的二倍体 状态。 有饲养层(feeder layer)培养法:以小鼠成纤维细胞 耐硫代鸟嘌呤和耐乌苯苷亚系(STO)或小鼠胚胎成纤 维细胞( Mouse Embryo Firbroblasts, MEF)制备饲 养细胞单层,主要是利用其分泌的生长因子FGF和抑制 干细胞分化因子白血病抑制因子(LIF)共同作用,保 持干细胞在体外克隆而不分化。 无饲养层培养法:利用各种能分泌抑制分化因子的细胞 制备条件培养基或在基础培养基中加入重组的LIF制备 条件培养基。
培养至细胞连成一片没有间隙(中间可补加处理过的细胞), 制备好的饲养单层置培养箱,5天内使用,使用前换成干细 胞培养液。
观察:


好的饲养单层,细胞连成一片,无间隙,死亡 细胞和杂细胞极少。 MEF和STO产生的抑制分化因子一部分分泌到 培养液中,一部分锚定在细胞外基质上。无间 隙的饲养单层保证了胚胎干细胞都能与饲养层 细胞接触而达到最佳效果。
胚胎采集:取孕3.5d(囊胚期或桑椹期)的母小鼠取胚胎 胚胎培养:培养皿内制备直径0.5cm左右露滴状培养液液 滴,并覆盖透明石蜡油,胚胎置于液滴中培养 胚胎干细胞分离:普通分离法、免疫外科法,弃除滋胚层 细胞,获得内细胞团(inner cell mass,ICM),并 分散为3-4个细胞在一起的细胞团
干细胞
分化细胞
干细胞
分 化 细 胞
对称分裂 (symmetry division)
不对称分裂 (asymmetry division)
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干细胞几个主要特征
干细胞本身不是终末分化细胞;具有多向分化的能力 (多能性或全能性),即可以分化发育成各种胚层组 织的细胞(ES细胞),或可以分化成为本系统各谱系 的细胞(特定组织干细胞,如造血干细胞)。
二、干细胞的分类
1、按分化潜能大小来分类:
全能干细胞( Totipotent stem cell ):能分化成所有组织
和器官的干细胞,它具有形成完整个体的分化潜能。如受精 卵,胚胎干细胞。 多能干细胞( pluripotent stem cell ),具有分化出多种组 织细胞的潜能,但却失去了发育成完整个体的能力,发育 潜能受到一定的限制。如骨髓多能造血干细胞是典型的例 子,它可分化出至少十二种血细胞 。 专能干细胞( unipotent stem cell ),这类干细胞只能向 一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化,如上皮组织 基底层干细胞、肌肉中的成肌细胞等。
干细胞的体外培养
一、干细胞的概念


干细胞 (stem cells, SC) 是一类具有自 我 复 制 能 力 (self-renewing) 的 多 潜 能 细胞,在一定条件下,它可以分化成多 种功能细胞。 干细胞是一种未充分分化,尚不成熟的 细胞,具有再生各种组织器官和人体的 潜在功能,医学界称之为“万用细胞”。
3、根据干细胞组织发生的名称进行分类:
胎胎干细胞 造血干细胞 骨髓间质干细胞 肌肉干细胞 成骨干细胞 内胚层干细胞来自百度文库视网膜干细胞 胰腺干细胞
三、干细胞研究的历史情况





1959年,美国首次报道了通过体外受精(IVF)动物。 60年代,几个近亲种系的小鼠睾丸畸胎瘤的研究表明其 来源于胚胎生殖细胞(embryonic germ cells, EG细 胞),此工作确立了胚胎癌细胞(embryonic carcinoma cells, EC细胞)是一种干细胞。 1968年,Edwards 和Bavister 在体外获得了第一个人 卵子。 70年代,EC细胞注入小鼠胚泡产生杂合小鼠。培养的EC 细胞作为胚胎发育的模型,虽然其染色体的数目属于异常。 1978年,第一个试管婴儿在英国诞生。
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