儿童哮喘血清生物标志物的筛选

文章编号: 1006-3617(2008)06-0528-04 中图分类号: Q503 文献标识码: A
【论著】
儿童哮喘血清生物标志物的筛选
袁东，沈春琳，姜智海，廖萍，张昀，王文静，张胜年*
摘要： ［目的］ 采用表面增强激光解析离子化飞行时间质谱技术（SELDI -TOF -MS）筛选儿童哮喘血清蛋白标志物，建立一个稳定、简便、快速的实验方法。

［方法］ 选择哮喘患儿、正常儿童各40例，按照年龄、性别1∶1配对，采用CM10芯片技术进行血清蛋白质组学研究，用蛋白芯片阅读器PBS Ⅱ对芯片进行扫描、分析。

［结果］ 哮喘患儿血清蛋白图谱与正常儿童相比，存在15个差异表达蛋白（P < 0.001），其中包括6个高表达蛋白，相对分子质量分别是5 339、5 639、5 908、4 718、5 847、9 300；9个低表达蛋白，相对分子质量分别是5 164、3 767、15 314、3 656、15 135、14 978、4 178、5 219、3 488。

明显高表达的潜在标志物2个，相对分子质量分别为5 339、4 718，以峰值比1.758为界值时，相对分子质量为5 339的蛋白，诊断儿童哮喘的灵敏度为75.61%，特异度为72.05%；以峰值比2.258为界值时，相对分子质量为4 718的蛋白，诊断儿童哮喘的灵敏度为70.73%，特异度为92.50%。

选用5 339、4 718、3 465、1 006建立决策树模型对样品进行筛选验证，其准确率为75%，灵敏度为80%，特异度为70%。

［结论］ 用该技术能筛选出灵敏度和特异度较好的差异表达蛋白，为儿童哮喘早期发现提供了一种新的实验方法，可能具有良好的临床应用前景。

关键词：儿童哮喘；生物标志物；飞行时间质谱技术；蛋白质组学
A Screening Study on Serum Biomarkers of Children Asthma by SELDI-TOF-MS YUAN Dong ，SHEN Chun-lin ，JIANG Zhi-hai ，LIAO Ping ，ZHANG Yun ，WANG Wen-jing ，ZHANG Sheng-nian *（Shanghai Municipal Center for Disease Control and Prevention ，Shanghai 200336，China ）
Abstract ： ［Objective ］ To select the specific biomarkers in serum of children asthma using surface -enhanced laser desorption and ionization time of flight mass spectrometry （SELDI -TOF -MS）protein chip technology. ［Methods ］ Serum samples from 40 children asthma patients，40 healthy children with matched gender and age were analyzed using CM10 protein chip to screen potential biomarkers. Proteomic spectra were generated by mass spectrometry. ［Results ］ Six high expressed potential biomarkers were identified with the relative molecular weights of 5 339，5 639，5 908，4 718，5 847 and 9 300. Nine low expressed potential biomarkers were identified with the relative molecular weights of 5 164，3 767，15 314，3 656，15 135，14 978，4 178，5 219 and 3 488. When the critical point was set as 1.758，the sensitivity of the protein 5 339 for diagnosing asthma was 75.61% and specificity was 72.05%. When the critical point was set as 2.258，the sensitivity of 5 339 for diagnosing asthma was 70.73% and specificity was 92.50%. The sensitivity for diagnosing asthma was 80% and the specificity was 70% by applying this protein fingerprint pattern validation. ［Conclusion ］ SELDI -TOF -MS protein chip technology is a quick，easy，convenient and high -throughput analyzing method，which is capable of selecting several specific，potential biomarkers from the serum of children asthma patients. It may be used clinically.
Key Words ：children asthma ；biomarker ；SELDI-TOF-MS ；proteomics
作者简介：袁东（1969-），男，医学硕士，副主任医师，研究方向：环
境毒理及环境相关疾病预防控制
*通讯作者（Correspondent author）：张胜年研究员，E -mail ：snzhang@
作者单位：上海市疾病预防控制中心，上海 200336
支气管哮喘是当前世界威胁公共健康最常见的慢性肺部疾病，哮喘发生可影响各年龄层人群，并以儿童多发。

截止目前，我国至少已有2 000万以上的哮喘患者，但是我国现在婴幼儿和儿童哮喘诊断符合率仅为66.7%，有16%在既往诊治中从未考虑喘息问题，而50%的哮喘患儿在发病后3年甚至更久才得到正确诊断［1］。

因此，寻找灵敏度好、特异性高的早期诊断方法是目前临床亟待解决的问题。

任何疾病在出现病理变化之前，细胞内的蛋白质在成分和数量上都会有相应的改变，所以，从理论上讲，通过对蛋白质的动态观察可以筛选出疾病早期的指标和征兆。

实现这种诊断的前提就是要找出各种疾病的特殊标志分子。

这种筛选是高通量的，用以前常规的方法难以达到。

蛋白质组学的开展和研究及其新兴技术的出现使这种大规模的筛选成为可能，同时也为疾病的诊断开辟了一个全新的分子诊断技术时期。

目前蛋白质组学研究的主要技术是双向电泳和质谱。

虽然双向电泳技术已经很成熟，但它复杂的实验过程和大量的样本需求不适合大规模的样本检测。

质谱具有高分辨率和高敏感性等优点，但它需要样本纯化，而且仪器价值昂贵，这些因素限制了双向电泳和质谱直接用于人群筛检。

而新出现的表面增强激光解析离子化飞行时间质谱技术（surface -enhanced laser desorption and
ionization time of flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS）能使组分复杂的生物样品（如细胞液或体液）中的各种蛋白质通过特定的表面基团吸附于蛋白质芯片上，用激光脉冲辐射使结合在芯片上的蛋白质解析形成荷电离子，这些不同质荷比的离子在真空电场中飞行的时间长短不同，据此绘制出质谱图，可以简便、快速地获得各种蛋白质的相对分子质量、丰度等信息［2，3］。

因此，本研究拟采用SELDI技术检测哮喘患儿和正常儿童血清中的表达蛋白，分析比较两组人群血清蛋白质谱差异，筛选出哮喘早期筛检、诊断的标志蛋白，为儿童哮喘早期发现提供了一种新的实验方法。

1 对象与方法
1.1 研究对象
1.1.1 样本来源 来自上海市儿童医院和上海市儿科医院就诊的哮喘患儿40例，其中男、女各20例，平均年龄（4.51±
2.76）岁（5个月~13岁）。

正常儿童40例，男、女各20例，平均年龄（4.89±
3.92）岁（2个月~13岁）。

1.1.2 实验分组 80例样品中，按照年龄、性别1∶1配对原则，随机选择60例（30例患者，30例对照）用于检测后建立决策树模型，剩余20例（10例患者，10例对照）用于建模后的筛选研究。

1.2 方法
1.2.1 血清标本制备 抽取样本儿童清晨空腹前臂静脉全血 5mL，于4℃，3000g离心10min。

取血清，分装后保存于-80℃冰箱。

1.2.2 血清样品处理 取分装的血清样品，于4℃复融。

融化的血清，再于4℃，10000g离心5min，取上清6μL。

加入12μL，9mol/L的尿素处理，于4℃的冰上，600g振摇30min。

最后加入50mmol/L pH为4.0的醋酸钠（NaAc）溶液222μL，混匀稀释。

1.2.3 蛋白质芯片检测 ①平衡芯片：取50mmol/L pH4.0的NaAc溶液200μL/孔加入芯片的加样孔中，平衡芯片2次，每次5min。

②芯片上样：取处理好的血清样品200μL/孔加入芯片的加样孔，置芯片于摇床混匀90min。

③样品洗脱：取50mmol/L pH4.0的NaAc溶液200μL/孔加入芯片的加样孔，洗脱2次，每次5min。

取300μL/孔的去离子水冲洗芯片。

④蛋白质获能：取能量吸收剂SPA（饱和芥子酸溶于体积分数50%乙腈和0.5%三氟乙酸）0.5μL/孔，加入芯片加样孔，待自然挥发后再加1次SPA。

所有操作均应在4℃条件下进行。

⑤芯片检测：将芯片置于Protein Chip Biomarker System Ⅱ质谱仪处理，以激光强度160，作用时间90ns，经计算机形成血清蛋白质质谱图。

1.2.4 数据处理 用Ciphergen Protein Chip软件和Biomarker Wizard软件对芯片检测得到的蛋白质相对含量及蛋白质相对分子质量数据进行处理，所有测得的蛋白质图谱进行统一标准化。

采用Biomarker Pattern Software建立决策树模型。

两组间蛋白峰相对强度值的比较应用t检验进行统计分析。

2 结果
2.1 哮喘患儿与正常儿童血清中蛋白质波谱峰比较
哮喘患儿与正常儿童血清蛋白质质谱图见图1，其中纵坐标为蛋白质相对峰度，横坐标为蛋白质相对分子质量。

2.2 哮喘患儿与正常儿童血清中差异表达蛋白质的价值评价
哮喘患儿与正常儿童血清差异表达蛋白筛选情况，见图2。

筛选出的15个哮喘差异表达蛋白质，包括6个高表达蛋白，波峰的相对分子质量分别为5339、5639、5908、4718、5847、9300；9个低表达蛋白，相对分子质量分别是5164、3767、15314、3656、15135、14978、4178、5219、3488。

明显高表达的潜在标志物2个，其相对分子质量分别为5339、4718，以峰值比1.758为界值时，相对分子质量为5339的蛋白，其诊断哮喘的灵敏度为75.61%，特异度为72.05%；以峰值比2.258为界值时，相对分子质量为4718的蛋白，其诊断哮喘的灵敏度为70.73%，特异度为92.50%，见表1。

图1 SELDI-TOF-MS筛选出的血清蛋白质图谱
Figure 1 Proteomic spectra of the serums were generated by SELTI-TOF-MS
表1 儿童哮喘高表达蛋白质
Table 1 High expressed potential biomarkers of children asthma
2.3 选择差异表达蛋白建立决策树模型
儿童哮喘的诊断模型由Ciphergen公司Biomarker Pattern Software（BPS）完成，通过选择差异蛋白峰建立决策树模型。

BPS自动选用相对分子质量5399、4718、3465、1006建立模型可以显著区分两组人群，具体结果见图3。

此决策树具有4层4个叶节点，60例样本在根节点处，被5339（节点1）标志蛋白分为两组，峰值>2.26的22例判断为哮喘患儿，峰值≤2.26的38例样本进入节点2，再用4718标志蛋白划分，峰值≤1.52的
18例样本判断为对照，峰值>1.52的20例样本进入节点3，被 3465 标志蛋白划分，峰值≤1.91的11例样本判断为患儿，峰值>1.91的9例样本进入节点4，用1006标志蛋白划分为两组，峰值≤20.91的7例样本判断为对照，峰值>20.91的2例样本判断为患儿。

2.4 建模后双盲筛选
随机抽取20例（10例患者、10例对照）血清，用CM10芯片得到其蛋白质图谱后，进入该决策树模型，该模型判断认为20例中8例为哮喘患儿，12例为正常。

与临床诊断对照后，10例哮喘患儿中8例被准确诊断为哮喘，2例被误判为正常对照；10例正常对照中7例被准确判断为正常对照，3例被误判为哮喘。

决策树判断模型盲法验证的准确率为75.00%，灵敏度为80.00%，特异度为70.00%。

3 讨论
哮喘是儿童常见的变态反应性疾病，近年来世界各国儿童哮喘的患病率有不断上升的趋势。

1998年世界卫生组织（WHO）估计全球哮喘患者1.55亿，至2000年全球哮喘防治的创议（global initiative for asthma，GINA）委员会估计全球患者有3亿，严重威胁人们的身心健康，成为当今世界十分受人关注的公共卫生问题。

目前全球发达国家儿童哮喘的患病率已高达10％以上。

流行病学调查显示我国儿童哮喘患病率逐年不断上升的趋势，上海儿童哮喘患病率从1990年1.50%上升到2000年3.34%，为全国最高［1］。

2006年上海市6~14岁学龄期儿童哮喘的患病率已达5.92％，是6年前（3.34％）的1.77倍［4］。

而目前哮喘诊断符合率却偏低，漏诊、误诊较多；缺乏有效的早期筛检、诊断生物标志物。

因此，寻找哮喘灵敏度高、特异性强的生物标志物很有必要。

新兴的蛋白质组学研究技术为满足这样的需求带来了希望的曙光。

SELDI-TOF-MS是一种新兴的蛋白质组学研究技术。

2002年诺贝尔化学奖获得者田中耕一于1993年提出该技术的基本原理。

同年，美国的HUTCHENS和YIP提出了改良的表面增强激光解析电离飞行时间质谱［5］。

基于这一技术，美
图2 哮喘患儿与正常儿童血清蛋白质图谱比较
Figure 2 The comparison of proteomic spectra between children asthma patients and healthy children
图3 哮喘患者血清差异表达蛋白决策树分类模型图
children asthma
国的Ciphergen公司开发出了SELDI蛋白质质谱系统（Protein Chip）［6］。

使用这种技术，组分复杂的生物样品中的各种蛋白质通过特定的表面基团吸附于蛋白质芯片上，用激光脉冲辐射使结合在芯片上的蛋白质解析形成荷电离子，这些不同质荷比的离子在真空电场中飞行的时间长短不同，据此绘制出质谱图，可以简便、快速地获得各种蛋白质的相对分子质量、丰度等信息。

将正常人样本的图谱信息同某种疾病患者相比较，就有望发现新的疾病特异性相关蛋白［7］。

SELDI技术的突出优势在于，可以分析低相对分子质量（<25000）蛋白质，低浓度（fmol级）蛋白质信息，并且可以测定疏水蛋白质，特别适于筛选疾病标志物。

2001年底以来，国内外采用该技术获得了乳腺癌［8，9］、前列腺癌［10］、肺癌［2，3］等肿瘤标志蛋白，且灵敏度、特异性较强。

本研究应用SELDI质谱技术筛选出15个差异表达蛋白，其中包括6个高表达蛋白，9个低表达蛋白。

明显高表达的潜在标志物2个，相对分子质量分别为5339、4718，以峰值比1.758为界值时，相对分子质量为5339的蛋白诊断儿童哮喘的灵敏度为75.61%，特异度为72.05%；以峰值比2.258为界值时，相对分子质量为4718的蛋白，其诊断儿童哮喘的灵敏度为70.73%，特异度为92.50%。

通过选择差异蛋白建立决策树模型，并对部分样品采用该模型进行盲法筛选验证，其准确率为75%。

，灵敏度为80%，特异度为70%。

而且SELDI蛋白质谱技术，具有几乎无创伤、简便、快捷等优点，可考虑将其用于儿童哮喘的诊断与早期筛查。

筛选出的2个明显高表达的标志蛋白，推测其性质可能是哮喘特异性表达蛋白分子，人体免疫系统产生的特异性蛋白质分子，人体免疫系统产生的非特异性炎性反应蛋白质分子。

本课题组下一步拟对上述差异表达蛋白进行深入研究，并进一步扩大样本含量使分析的结果更加完善，以便于其更好地服务于儿童哮喘早期筛检及临床诊断。

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（收稿日期：2008-08-26）
（校对：丁瑾瑜）［１］
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