基因克隆优秀课件
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选用cDNA克隆这一实验方案，必须考虑到目的基 因的mRNA在特定的生物体组织中的含量问题。
在许多组织和培养的细胞中，各种mRNA的含量都 是极不相同的。其中，有些类型的mRNA含量十分 丰富，每个细胞可拥有数千个拷贝，而有些类型 的mRNA的含量则相反，每个细胞只有少数几个拷 贝。
根据mRNA分子含量的多少，可以将mRNA划分为高 丰度、中丰度和胞内转录水平上的基因的群体 ，并不能包括该生物的全部基因，且这些 基因在的提取和 mRNA 分离； 第二，第一链 cDNA 合成； 第三，第二链 cDNA 合成； 第四，双链 cDNA 克隆进质粒或噬菌体载 体并导入宿主中繁殖。
基因克隆
分子克隆
基本概念:
DNA重组技术是在分子水平对基因进行体外操作， 因而也称为分子克隆(molecular cloning)或基因 克隆。
基本概念:
• 分子克隆：是在体外对DNA分子按照既定的目的和 方案进行人工重组，将重组分子导入到合适的受体 细胞中，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得DNA分 子大量复制，并使受体细胞获得新得遗传特征的过 程
缺点：必须从3’端开始，不利于较长mRNA 的逆转录；由于cDNA末端存在较长的poly A而影响cDNA测序。
随机引物引导的cDNA合成：
采用 6－10 个随机碱基的寡核苷酸短片段 作为合成第一链cDNA的引物。
cDNA的合成可以从mRNA模板的许多位点同 时发生。
对于特长的mRNA分子中靠近5’-端的序列， 应用此方法较为容易得到克隆。
基因克隆的含义
“基因”：完整基因/等位基因型/基因片段； DNA基因/RNA基因/未知基因？
找到基因
获得基因一定数量的拷贝 分析基因的结构等特征
确定 克 隆的方法保存在宿主细胞中的DNA重组体的 群体，每一重组子只含一种mRNA信息。
功能克隆
氨基酸序列
特异蛋白质 抗体
核苷酸序列
PCR目的基因基因筛选评价优点 -- 在单基因性状的基因分离方面仍为常用策略
缺点 -- 特异蛋白质确定、鉴定及其纯化困难 -- 难以分离微量表达基因 -- 无法研究无蛋白质产物的基因 -- 难以进组织中的胰岛素基因的mRNA，血红蛋白细胞 中的珠蛋白基因的mRNA，等等都属于高丰度mRNA 。从这些组织或细胞分离出来的细胞质且mRNA制 剂中，目的基因mRNA的比例可高达50%～90%。
这类特殊的mRNA甚至不需要进一步纯化就可以直 接用载体构建因克隆的策略
功能克隆（ functional cloning）
--- 根据特异蛋白质分离目的基因的策略
表型克隆（ phenotype cloning ）
--- 根据特异mRNA 分离目的基因的策略
使用体外标记的mRNA或cDNA作探针，可以 检测出仅占总mRNA0.05%-0.1%的低丰度 mRNA的cDNA克隆。
稀少mRNA的cDNA克隆
应用按分子量大小分部分离的技术富集克隆的 mRNA
使用化学合成的寡聚脱氧核苷酸纯化特定的mRNA
差别杂交法筛子比较小，可以在质粒载体上克隆。在早期，人们 外源DNA插入的能力有限，而且小分子量的 质粒载体复制频率要比大分子量的重组质粒载体高得多。 后者在复制过程中会再次受到选择，发生插入序列的逐渐 丢失。
细胞总RNA的分离
mRNA分子3’末端均含有一段polyA尾巴 一段oligo(dT)能够同惰性物质如纤维素或
琼脂糖结合。当细胞总RNA制剂通过已用 oligo(dT)处理过的纤维素柱时，mRNA分子 的poly A尾巴便会同oligo(dT)序列杂交而 粘附到柱子上。 用不同离子浓度的缓冲液进行洗脱，即可 分离得到mRNA。
总RNA电泳图
1、人脑， 2、人脂肪，3、人胰腺，4 、 小鼠脑， 5 、小鼠卵巢， 6 、大鼠肾，7 、大鼠胃
合成第一链cDNA
由mRNA到cDNA 过程称为反转录，是由反转 录酶（reverse transcriptase）催化的。
oligo(dT)引导的cDNA合成：
引物oligo(dT)引物与mRNA的3'末端polyA 配对，引导反转录酶以mRNA为模板合成第 一链cDNA 。
高丰度mRNA的cDNA克隆的检测，一般是用32P标记 的探针，从转化的细菌群体中筛选出含有目的基 因序列的重组体克隆。
稀少mRNA的cDNA克隆
低丰度的mRNA的5个克隆就已足够了。
一些含量极低的稀少mRNA的cDNA克隆，是 无法应用菌落原位杂交技术检测的。
合成第二链cDNA
双链 cDNA 克隆进载体
先用末端转移酶给双链cDNA分子加尾，或 者更常用的是将人工合成的衔接物加到双 链cDNA分子的两端，而后再同经适当处理 而具有相应末端的载体分子连接。
将如此构成的重组体分子导入大肠杆菌寄 主细重组DNA技术将某种生物细胞的总DNA或染色体DNA 的所有片断随机地连接到基因载体上,然后转移到适 当的宿主细胞中，通过细胞增殖而构成各个片段的 无性繁殖系（克隆），在制备的克隆数目多到可以 把某种生物的全部基因都包含在内的情况下，
在许多组织和培养的细胞中，各种mRNA的含量都 是极不相同的。其中，有些类型的mRNA含量十分 丰富，每个细胞可拥有数千个拷贝，而有些类型 的mRNA的含量则相反，每个细胞只有少数几个拷 贝。
根据mRNA分子含量的多少，可以将mRNA划分为高 丰度、中丰度和胞内转录水平上的基因的群体 ，并不能包括该生物的全部基因，且这些 基因在的提取和 mRNA 分离； 第二，第一链 cDNA 合成； 第三，第二链 cDNA 合成； 第四，双链 cDNA 克隆进质粒或噬菌体载 体并导入宿主中繁殖。
基因克隆
分子克隆
基本概念:
DNA重组技术是在分子水平对基因进行体外操作， 因而也称为分子克隆(molecular cloning)或基因 克隆。
基本概念:
• 分子克隆：是在体外对DNA分子按照既定的目的和 方案进行人工重组，将重组分子导入到合适的受体 细胞中，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得DNA分 子大量复制，并使受体细胞获得新得遗传特征的过 程
缺点：必须从3’端开始，不利于较长mRNA 的逆转录；由于cDNA末端存在较长的poly A而影响cDNA测序。
随机引物引导的cDNA合成：
采用 6－10 个随机碱基的寡核苷酸短片段 作为合成第一链cDNA的引物。
cDNA的合成可以从mRNA模板的许多位点同 时发生。
对于特长的mRNA分子中靠近5’-端的序列， 应用此方法较为容易得到克隆。
基因克隆的含义
“基因”：完整基因/等位基因型/基因片段； DNA基因/RNA基因/未知基因？
找到基因
获得基因一定数量的拷贝 分析基因的结构等特征
确定 克 隆的方法保存在宿主细胞中的DNA重组体的 群体，每一重组子只含一种mRNA信息。
功能克隆
氨基酸序列
特异蛋白质 抗体
核苷酸序列
PCR目的基因基因筛选评价优点 -- 在单基因性状的基因分离方面仍为常用策略
缺点 -- 特异蛋白质确定、鉴定及其纯化困难 -- 难以分离微量表达基因 -- 无法研究无蛋白质产物的基因 -- 难以进组织中的胰岛素基因的mRNA，血红蛋白细胞 中的珠蛋白基因的mRNA，等等都属于高丰度mRNA 。从这些组织或细胞分离出来的细胞质且mRNA制 剂中，目的基因mRNA的比例可高达50%～90%。
这类特殊的mRNA甚至不需要进一步纯化就可以直 接用载体构建因克隆的策略
功能克隆（ functional cloning）
--- 根据特异蛋白质分离目的基因的策略
表型克隆（ phenotype cloning ）
--- 根据特异mRNA 分离目的基因的策略
使用体外标记的mRNA或cDNA作探针，可以 检测出仅占总mRNA0.05%-0.1%的低丰度 mRNA的cDNA克隆。
稀少mRNA的cDNA克隆
应用按分子量大小分部分离的技术富集克隆的 mRNA
使用化学合成的寡聚脱氧核苷酸纯化特定的mRNA
差别杂交法筛子比较小，可以在质粒载体上克隆。在早期，人们 外源DNA插入的能力有限，而且小分子量的 质粒载体复制频率要比大分子量的重组质粒载体高得多。 后者在复制过程中会再次受到选择，发生插入序列的逐渐 丢失。
细胞总RNA的分离
mRNA分子3’末端均含有一段polyA尾巴 一段oligo(dT)能够同惰性物质如纤维素或
琼脂糖结合。当细胞总RNA制剂通过已用 oligo(dT)处理过的纤维素柱时，mRNA分子 的poly A尾巴便会同oligo(dT)序列杂交而 粘附到柱子上。 用不同离子浓度的缓冲液进行洗脱，即可 分离得到mRNA。
总RNA电泳图
1、人脑， 2、人脂肪，3、人胰腺，4 、 小鼠脑， 5 、小鼠卵巢， 6 、大鼠肾，7 、大鼠胃
合成第一链cDNA
由mRNA到cDNA 过程称为反转录，是由反转 录酶（reverse transcriptase）催化的。
oligo(dT)引导的cDNA合成：
引物oligo(dT)引物与mRNA的3'末端polyA 配对，引导反转录酶以mRNA为模板合成第 一链cDNA 。
高丰度mRNA的cDNA克隆的检测，一般是用32P标记 的探针，从转化的细菌群体中筛选出含有目的基 因序列的重组体克隆。
稀少mRNA的cDNA克隆
低丰度的mRNA的5个克隆就已足够了。
一些含量极低的稀少mRNA的cDNA克隆，是 无法应用菌落原位杂交技术检测的。
合成第二链cDNA
双链 cDNA 克隆进载体
先用末端转移酶给双链cDNA分子加尾，或 者更常用的是将人工合成的衔接物加到双 链cDNA分子的两端，而后再同经适当处理 而具有相应末端的载体分子连接。
将如此构成的重组体分子导入大肠杆菌寄 主细重组DNA技术将某种生物细胞的总DNA或染色体DNA 的所有片断随机地连接到基因载体上,然后转移到适 当的宿主细胞中，通过细胞增殖而构成各个片段的 无性繁殖系（克隆），在制备的克隆数目多到可以 把某种生物的全部基因都包含在内的情况下，