高糖诱导肝细胞脂肪变性的机制探讨

高糖诱导肝细胞脂肪变性的机制探讨

【摘要】目的：探讨高糖诱导肝细胞脂变中的可能机制。方法：分别以18、25mmol/l的葡萄糖浓度培养l02细胞，以11mmol/l葡萄糖浓度培养l02细胞作为对照，测定细胞内甘油三酯（tg）含量反应肝细胞脂变程度；rt-pcr检测乙酰辅酶a羧化酶（acetyl-coa carboxylase，acc）、固醇调节元件结合蛋白1c（sterol regulatory element binding protein 1c ，srebp-1c）的mrna表达水平，western blot分析乙酰辅酶a羧化酶、肝x受体α（liver x receptor alpha ，lxrα）的蛋白表达水平。结果：与对照组比较，高糖可促进l02细胞内甘油三酯含量增加，上调acc mrna和acc蛋白的表达量，而高糖组各时间点srebp-1c mrna 和lxrα蛋白表达与对照组比较无明显变化。结论：1、高糖可通过上调acc的表达，参与肝细胞脂肪沉积的形成过程。2、lxrα- srebp-1c -acc途径可能没有参与葡萄糖及其代谢产物诱导的肝细胞脂肪沉积。

【关键词】高糖；肝细胞脂肪变性；乙酰辅酶a羧化酶；肝x受体α；固醇调节元件结合蛋白1c

【中图分类号】r589 【文献标识码】a 【文章编号】1004—7484（2013）09—0022—003

糖尿病和脂肪肝是常见的伴发疾病，在糖尿病患者中，脂肪肝的发病率明显增加，而当前对于这种现象的机制并不十分清楚，因此，研究nafld的具体发病机制，制定有效防治措施显得刻不容缓。

目前葡萄糖代谢信号途径在脂肪肝形成中的作用及可能机制引

起了广泛的关注，我们既往研究[6]发现碳水化合物反应元件结合蛋白（carbohydrate response element binding protein， chrebp）在糖和脂肪代谢过程中发挥着重要的作用，调节糖酵解和脂肪酸合成酶基因的表达，但也有学者认为 [4]，过多的葡萄糖可直接作为lxrα的配体，上调lxrα靶基因如srebp-lc、acc等的表达，影响肝脏的脂肪沉积。

本实验利用高糖体外培养人正常肝细胞（l02细胞），观察l02细胞的脂肪沉积、lxrα、srebp-lc、 acc表达的变化，从正常人肝细胞水平探讨高糖条件下肝脂肪形成的可能机制，为进一步防治脂肪肝提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料 l02 细胞（重庆医科大学附二院消化内科实验室保存）；甘油三酯试剂盒（南京建成生物研究所）；acc、lxrα抗体（美国santa cruz公司）；β-actin抗体、gapdh抗体（碧云天生物研究所）； rna提取试剂盒、pcr试剂盒、rt试剂盒（日本takara 公司）；acc引物、srebp-1c引物、β-actin1引物、β-actin2引物（大连宝生物公司）。

1.2方法

1.2.1细胞培养用含10%胎牛血清的rpmi 1640培养基培养l02细胞，置入37℃含5%c02孵箱，当细胞贴壁约85%时，用含0.25%胰蛋白酶溶液消化，收集并传代。

1.2.2 实验分组根据文献研究[3]，实验分为3组：g1组（葡萄

糖浓度为11mmol/l，为对照组），g2组（葡萄糖浓度为18mmol/l）和g3组（葡萄糖浓度为25mmol/l）。

1.2.3 tg含量检测高糖刺激24、48h后收集细胞，按试剂盒说明进行操作，并行细胞蛋白定量，计算每毫克蛋白所对应的tg含量。

1.2.6 acc 、srebp-1cmrna表达的检测分别在高糖刺激0，3，6， 12，24，36，48h提取l02细胞总rna，检测细胞总rna的纯度和完整性，用rt-pcr方法检测acc、srebp-1c基因的mrna表达量。acc-1上游引物：5-acctgtgggagtagttgctg-3，下游引物：

5-attagaggtagcccttcacg-3，扩增片段长度为180bp，β-actin1 上游引物： 5-gggacctgactgactacctc-3，下游引物：

5-cgtcatactcctgcttcctg-3，扩增片段长度为540bp。srebp-1c上游引物：5-cccagaaactcaagcgagaac-3，下游引物：

5-ctttgctgtcctcaaagactgg-3，扩增片段长度为274bp；β-actin2 上游引物：5-gacccagatcatgtttgagacc-3，下游引物：

5-atctccttctgcatcctgtcg-3，扩增片段长度为625bp。pcr反应条件为：94℃预变性2min，94℃变性30 s， 53℃退火30 s， 72℃延伸30s，共35个循环， 72℃再延伸2min。取反应产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果经凝胶成像分析仪成像，计算出目的条带与内参条带光密度的比值。

1.2.7 acc、lxrα蛋白表达的检测分别在高糖刺激24、48h提取l02细胞总蛋白，bca法检测蛋白浓度，使用电泳胶进行电泳分

离，然后转膜，封闭液封闭，把膜放入一抗中，温箱中温育2小时，取出膜， pbst洗涤，然后加入相应二抗中，温育1小时，取出膜，pbst洗涤，dab 显色剂显色，于凝胶成像分析仪中成像，计算每个样本与内参光密度值的比值。

统计学处理：数据以均数±标准差表示，用spss16.0软件进行统计分析，，多组均数的比较采用单因素方差分析，两两之间比较用t检验， p 2.2 葡萄糖对l02细胞acc、srebp-1c mrna表达的影响

与对照组比较，高糖组细胞随着葡萄糖作用时间的延长， acc mrna表达量逐渐增加（p=0.0000），与对照组比较，高糖组细胞各时间点srebp-1c mrna差异无统计学意义（p>0.05）。（见图1、图2、表2）

高糖组各时间点与对照组比较，a p =0.0211，b p =0.0012， c p =0.0011，dp =0.0002；高糖组内与前一时间点比较，e p =0.0162，

f p =0.0188，

g p =0.0284， hp =0.0328

2.3葡萄糖对l02细胞acc、lxrα蛋白质表达的影响

与对照组比较，高糖组细胞24h、48h的acc蛋白表达增加，差异均有统计学意义（p=0.0030和p=0.0001）；与对照组比较，高糖组细胞24h、48h的lxrα蛋白差异无统计学意义（p>0.05）。（见图3、图4、表3）

3 讨论

srebp-lc是碱性螺旋-环-螺旋-亮氨酸锌指（bhlh-zip）转录因