《无菌技术》PPT课件
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从染菌幅度看：各个发酵罐或多数发酵罐染菌，且所 污染的是同一种杂菌，一般是空气系统问题，若个别 罐连续染菌，一般是设备问题。
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3. 预防
种子带菌的防治 灭菌彻底 接种可靠：无菌室及设备可靠，无菌操作可 靠 保藏可靠
过滤空气带菌的防治 设备的渗漏或“死角”造成的染菌及其防治
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22
三、发酵工业的无菌技术——灭菌方法
干热灭菌法 湿热灭菌法 射线灭菌法 化学药剂灭菌法 过滤除菌法 火焰灭菌法
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23
四、培养基及设备灭菌
（一）湿热灭菌原理 （二）分批灭菌（实罐灭菌） （三）连续灭菌（连消） （四）分批灭菌与连续灭菌的比较
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（一）湿热灭菌原理
杀菌剂的添加：前期无必要，增加成本； 发现后加入，效果要具体评价
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10
（4）杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的影响
丝状菌发酵被产酸菌污染：pH不断下降，菌丝大量自 溶，发酵液粘度增加，过滤困难 处理方法：①将发酵液加热后再加助滤剂；②先加絮 凝剂使蛋白质凝聚后沉淀
杂菌分泌较多蛋白质杂质时，对发酵后处理过程中采 用溶媒萃取的提取工艺非常不利，使水相和溶媒之间 极易发生乳化
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本章内容
一、概念 二、发酵工业污染的防治策略 三、发酵工业的无菌技术 四、培养基及设备灭菌 五、空气除菌
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一、概念:灭菌、消毒、除菌、防腐
灭菌(sterilization):用化学或物理方法杀死物料或设备中所有有生命 物质的过程。 消毒(disinfection):用物理或化学方法杀死空气、地表以及容器和器 具表面的微生物。 除菌(degermation): 用过滤方法除去空气或液体中的微生物及其孢子。 防腐(antisepsis): 用物理或化学方法杀死或抑制微生物的生长和繁殖 。
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“死角”
发酵罐的“死角” 法兰、内衬、接口、表头、罐内部件及其支撑件如搅拌 轴拉杆、联轴器、冷却盘管、挡板、空气分布管及其支 撑件 口：人孔（或手孔）、排风管接口、灯孔、视镜口、进 料管口 发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角” 消除方法：加强清洗并定期铲除污垢；安装放汽边阀
管道安装不当或配置不合理形成的“死角”
消毒与灭菌的区别 消毒与灭菌在发酵工业中的应用
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二、发酵工业污染的防治策略
（一）污染的危害 （二）污染的防治
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4
1.染菌的不良后果
消耗营养 合成新产物；菌体自溶、发粘等造成分离困难 改变pH 分解产物 噬菌体破坏极大
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2.染菌危害的具体分析 （1）染菌对不同菌种发酵的影响
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1. 染菌的检查与判断
显微镜检查法 镜检出杂菌需要一定时间
平板划线培养或斜面培养检查法：菌落 噬菌体检查可采用双层平板法：噬菌斑
肉汤培养检查法 发酵过程的异常现象判断
DO2水平异常变化 pH异常变化 尾气CO2异常变化
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1 2
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13
2. 污染原因分析
菌。 C. 酵母菌: 易污染细菌以及野生酵母菌 D. 疫苗：无论污染的是活菌、死菌或内外毒素，
都应全部废弃。
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（2）染菌种类对发酵的影响
青霉素：怕染细短产气杆菌 链霉素：怕染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌 四环素：怕染双球菌、芽孢杆菌和荚膜杆菌 柠檬酸：怕染青霉菌 肌苷（酸）：怕染芽孢杆菌 谷氨酸：怕染噬菌体，易造成连续污染
b. 污染酵母：加入0.025~0.035g/L CuSO4抑制酵母； 通风加大，加速产酸。
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（3）不同发酵时期染菌对发酵的影响
柠檬酸发酵
c.染黄曲霉：加入另一罐将近发酵成熟的醪液，pH下
降，黄曲霉自溶。 d.青霉菌：在pH很低下能够生长。提前放罐。
发酵后期污染 染菌量不太多，可继续发酵 污染严重，则提前放罐
操作不当造成染菌 噬菌体染菌及其防治
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采取哪些措施能够保持无菌发酵？
物料、培养基、中间补料要灭菌； 发酵设备及辅助设备（空气过滤装置、各种发
酵罐进出口连接装置）和管道要灭菌； 好气发酵通入的空气要除菌； 种子无污染；接种无菌操作过关； 为了保持发酵的长期无菌状态，需维持正压。
主要原因： ① 种子带菌 ② 无菌空气带菌 ③ 设备渗漏 ④ 灭菌不彻底 ⑤操作失误 ⑥技术管理不善
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2. 污染原因分析
从污染时间看：早期污染可能与①②④⑤→接种操作 不当有关；后期污染可能与③⑤及中间补料有关。
从杂菌种类看： 耐热芽孢杆菌：与④有关 球菌、无芽孢杆菌：与① ② ③⑤有关 浅绿色菌落的杂菌：与水有关，即冷却盘管渗漏 霉菌：与④⑤有关，即无菌室灭菌不彻底或操作问 题 酵母菌：糖液灭菌不彻底或放置时间较长
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（3）不同发酵时期染菌对发酵的影响
种子扩大时期染菌: 灭菌后弃去
发酵前期染菌： 应迅速重新灭菌，补充必要的营养成分，重新接种
发酵中期染菌：挽救困难，应早发现，快处理 ，处理方 法应根据各种发酵的特点和具体情况来决定
百度文库
▪ 抗生素发酵
▪ 柠檬酸发酵
a. 污染细菌：加大通风，加速产酸，调pH3.0，抑制 细菌
1. 热阻 2. 微生物热死定律：对数残留定律 3.灭菌温度和时间的选择 4. 影响培养基灭菌的其它因素
A．细菌 谷氨酸：发酵周期短，培养基不太丰富，较少
染杂菌，但噬菌体威胁大。 肌苷：缺陷型生产菌，培养基丰富，易染菌，
营养成分迅速被消耗，严重抑制菌生长和合成 代谢产物。
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6
（1）染菌对不同菌种发酵的影响
B. 霉菌 PenG：青霉素水解酶上升，PenG迅速破坏，
发酵一无所获。 柠檬酸：pH2.0，不易染菌，主要防止前期染
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污水
脓疱
罐底
发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角”
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18
法兰连接不当造成的“死角”
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19
灭菌时蒸汽不易通达的“死角”及其消除方 法
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3. 预防
培养基与设备灭菌不彻底的防治 原料性状：大颗粒的原料过筛除去。 实罐灭菌时要充分排除罐内冷空气。 灭菌过程中产生的泡沫造成染菌：添加消泡剂 防止泡沫升顶 连消不彻底 ：最好采用自动控制装置 灭菌后期罐压骤变 死角
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3. 预防
种子带菌的防治 灭菌彻底 接种可靠：无菌室及设备可靠，无菌操作可 靠 保藏可靠
过滤空气带菌的防治 设备的渗漏或“死角”造成的染菌及其防治
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三、发酵工业的无菌技术——灭菌方法
干热灭菌法 湿热灭菌法 射线灭菌法 化学药剂灭菌法 过滤除菌法 火焰灭菌法
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四、培养基及设备灭菌
（一）湿热灭菌原理 （二）分批灭菌（实罐灭菌） （三）连续灭菌（连消） （四）分批灭菌与连续灭菌的比较
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（一）湿热灭菌原理
杀菌剂的添加：前期无必要，增加成本； 发现后加入，效果要具体评价
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（4）杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的影响
丝状菌发酵被产酸菌污染：pH不断下降，菌丝大量自 溶，发酵液粘度增加，过滤困难 处理方法：①将发酵液加热后再加助滤剂；②先加絮 凝剂使蛋白质凝聚后沉淀
杂菌分泌较多蛋白质杂质时，对发酵后处理过程中采 用溶媒萃取的提取工艺非常不利，使水相和溶媒之间 极易发生乳化
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本章内容
一、概念 二、发酵工业污染的防治策略 三、发酵工业的无菌技术 四、培养基及设备灭菌 五、空气除菌
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一、概念:灭菌、消毒、除菌、防腐
灭菌(sterilization):用化学或物理方法杀死物料或设备中所有有生命 物质的过程。 消毒(disinfection):用物理或化学方法杀死空气、地表以及容器和器 具表面的微生物。 除菌(degermation): 用过滤方法除去空气或液体中的微生物及其孢子。 防腐(antisepsis): 用物理或化学方法杀死或抑制微生物的生长和繁殖 。
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“死角”
发酵罐的“死角” 法兰、内衬、接口、表头、罐内部件及其支撑件如搅拌 轴拉杆、联轴器、冷却盘管、挡板、空气分布管及其支 撑件 口：人孔（或手孔）、排风管接口、灯孔、视镜口、进 料管口 发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角” 消除方法：加强清洗并定期铲除污垢；安装放汽边阀
管道安装不当或配置不合理形成的“死角”
消毒与灭菌的区别 消毒与灭菌在发酵工业中的应用
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二、发酵工业污染的防治策略
（一）污染的危害 （二）污染的防治
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1.染菌的不良后果
消耗营养 合成新产物；菌体自溶、发粘等造成分离困难 改变pH 分解产物 噬菌体破坏极大
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2.染菌危害的具体分析 （1）染菌对不同菌种发酵的影响
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11
1. 染菌的检查与判断
显微镜检查法 镜检出杂菌需要一定时间
平板划线培养或斜面培养检查法：菌落 噬菌体检查可采用双层平板法：噬菌斑
肉汤培养检查法 发酵过程的异常现象判断
DO2水平异常变化 pH异常变化 尾气CO2异常变化
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2. 污染原因分析
菌。 C. 酵母菌: 易污染细菌以及野生酵母菌 D. 疫苗：无论污染的是活菌、死菌或内外毒素，
都应全部废弃。
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（2）染菌种类对发酵的影响
青霉素：怕染细短产气杆菌 链霉素：怕染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌 四环素：怕染双球菌、芽孢杆菌和荚膜杆菌 柠檬酸：怕染青霉菌 肌苷（酸）：怕染芽孢杆菌 谷氨酸：怕染噬菌体，易造成连续污染
b. 污染酵母：加入0.025~0.035g/L CuSO4抑制酵母； 通风加大，加速产酸。
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（3）不同发酵时期染菌对发酵的影响
柠檬酸发酵
c.染黄曲霉：加入另一罐将近发酵成熟的醪液，pH下
降，黄曲霉自溶。 d.青霉菌：在pH很低下能够生长。提前放罐。
发酵后期污染 染菌量不太多，可继续发酵 污染严重，则提前放罐
操作不当造成染菌 噬菌体染菌及其防治
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采取哪些措施能够保持无菌发酵？
物料、培养基、中间补料要灭菌； 发酵设备及辅助设备（空气过滤装置、各种发
酵罐进出口连接装置）和管道要灭菌； 好气发酵通入的空气要除菌； 种子无污染；接种无菌操作过关； 为了保持发酵的长期无菌状态，需维持正压。
主要原因： ① 种子带菌 ② 无菌空气带菌 ③ 设备渗漏 ④ 灭菌不彻底 ⑤操作失误 ⑥技术管理不善
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2. 污染原因分析
从污染时间看：早期污染可能与①②④⑤→接种操作 不当有关；后期污染可能与③⑤及中间补料有关。
从杂菌种类看： 耐热芽孢杆菌：与④有关 球菌、无芽孢杆菌：与① ② ③⑤有关 浅绿色菌落的杂菌：与水有关，即冷却盘管渗漏 霉菌：与④⑤有关，即无菌室灭菌不彻底或操作问 题 酵母菌：糖液灭菌不彻底或放置时间较长
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（3）不同发酵时期染菌对发酵的影响
种子扩大时期染菌: 灭菌后弃去
发酵前期染菌： 应迅速重新灭菌，补充必要的营养成分，重新接种
发酵中期染菌：挽救困难，应早发现，快处理 ，处理方 法应根据各种发酵的特点和具体情况来决定
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▪ 抗生素发酵
▪ 柠檬酸发酵
a. 污染细菌：加大通风，加速产酸，调pH3.0，抑制 细菌
1. 热阻 2. 微生物热死定律：对数残留定律 3.灭菌温度和时间的选择 4. 影响培养基灭菌的其它因素
A．细菌 谷氨酸：发酵周期短，培养基不太丰富，较少
染杂菌，但噬菌体威胁大。 肌苷：缺陷型生产菌，培养基丰富，易染菌，
营养成分迅速被消耗，严重抑制菌生长和合成 代谢产物。
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（1）染菌对不同菌种发酵的影响
B. 霉菌 PenG：青霉素水解酶上升，PenG迅速破坏，
发酵一无所获。 柠檬酸：pH2.0，不易染菌，主要防止前期染
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污水
脓疱
罐底
发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角”
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法兰连接不当造成的“死角”
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灭菌时蒸汽不易通达的“死角”及其消除方 法
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3. 预防
培养基与设备灭菌不彻底的防治 原料性状：大颗粒的原料过筛除去。 实罐灭菌时要充分排除罐内冷空气。 灭菌过程中产生的泡沫造成染菌：添加消泡剂 防止泡沫升顶 连消不彻底 ：最好采用自动控制装置 灭菌后期罐压骤变 死角