第2章 酶反应的基本原理

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1
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7
8
[S]
底物浓度对酶促反应速度的影响
（1）米氏方程（Michaelis-Menten equation）
V=
米氏方程解释：
当[S]Km时，v=(Vmax/Km) [S], 即v 正比于[S]
当[S]Km时，v Vmax, 即[S]而v不变
Vmax [S] Km + [S]
米氏方程成立条件：
初速度为标准 单底物 稳态（steady state）
（2）米氏方程推导

•
（3）米氏常数的意义
1、当反应速度等于最大反应速度一半时，即 V=1/2 Vmax,
Km=[S],米氏常数的单位为摩尔/L 。
•
2、不同的酶具有不同Km值，它是酶的一个重要的特征物理常 数。
•
3、Km值只是在固定的底物，一定的温度和 pH 条件下，一定 的缓冲体系中测定的，不同条件下具有不同的Km值。
定向即底物和酶的活性中心结合时，可诱导酶蛋白的构象变化， 使底物和酶的活性中心更好地互补，并使底物有正确的定向。这 样，底物的反应基团更趋近酶的催化基团。这又进一步使反应速 度提高几个数量级。
4、底物分子的形变与扭曲张力学说（strain）

（1）酶受底物诱导发生构象改变，特别是活性中心的功 能基团发生的位移或改向，呈现一种高活性功能状态。 （2）酶活性中心的某些基团或金属离子可改变底物敏感 健的电子云分布，产生“电子张力”而易于断裂，也可 使底物的构象改变，接近过渡态 而易于反应，这就 是张力（）学说。 羧肽酶A和溶菌酶的X线衍射分析证明了张力效应是 酶催化的机制之一。
活性中心：结合部位和催化部位

酶活性中心示意图
多肽链 活性中心外 的必需基团
必需基团(essential group) ： 酶分子中氨基酸残基侧链的化学基团中，一些与酶活性 密切相关的基团。
底物分子

酶的活性中心(active
center)/活性部位(active site）：
必需基团在空间结构上彼此靠近，组成具有特定空间结 构的区域，能与底物特异结合并将底物转化为产物。


（3）与生物膜结合 一种结构更高的多酶复合体，酶整齐的排列在 生物膜上。催化效率最高。（如呼吸链）
酶1
酶3
酶2 酶4
酶5
3、酶的组成 单成份酶：脲酶、蛋白酶、淀粉酶、核糖核酸 酶等。 （简单蛋白质） 酶蛋白 （apoenzyme） 双成份酶 辅酶（coenzyme) （结合蛋白质） 辅因子 （cofacter) 辅基(prosthetic group)
酶活性中心广义酸碱基团
广义酸基团 （质子供体） 广义碱基团 （质子受体） pKa
COOH NH 3+ NH SH
OH
.. NH
NH SH
COO 2
NH 2+ NH 2
.. NH
NH 2
O
3.96(Asp),4.32(Glu ) 10.80 12.48 8.33 10.11 6.00
HN
NH +
HN
产物

程
酶促反应活化能的改变
反
应
过
酶的催化不需要较高 的反应温度。
2、酶的聚集方式

（1）松散排列 酶在细胞中各自以可溶的单体形式存在，彼此没有 结构上的联系。 反应时酶是随机扩散，催化效率不高。（如糖酵解 历程）
酶1 酶3
酶4 酶2
酶5
（2）簇式排列 几种酶有机地聚集在一起，镶嵌成一定的结 构，形成多酶复合体。催化效率高。 （如丙酮酸脱氢酶复合体、脂肪酸合成酶、纤维 素酶复合体）
Km
1
1
1/v
0.6
= + V Vmax [S] Vmax
0.4
-1/Km
0.2
1/Vmax
0.0 -4 -2 0 2 4
-1
6
8
10
1/[S](1/mmol.L )
例题
D-丝氨酸脱水酶需要磷酸吡哆醛作为辅酶。催化反应： CH2OH · CHNH2 · COOH CH3CO · COOH+NH3 在实验中测定酶的磷酸吡哆醛饱和曲线得到下列数据： [s] 磷酸吡哆醛10 -5（M） 0.20 0.40 0.85 1.25 1.70 2.00 8.00 v 20分钟生成丙酮酸（M） 0.150 0.200 0.275 0.315 0.340 0.350 0.360
e 二硫键
f 酯键
键作用力性能

氢键、范德华力、疏水相互作用力、盐键，均为次级键 氢键、范德华力虽然键能小，但数量大 疏水相互作用力对维持三级结构特别重要 盐键数量小 二硫键对稳定蛋白质构象很重要，二硫键越多，蛋白质分子构象越稳定
离子键
氢键
范德华力
疏水相互作用力
5、酶的活性基团及活性中心
酶
4、酶的结构层次
一级结构
二级结构
三级结构
四级结构
维持蛋白质结构的作用力

维系蛋白质分子的一级结构：肽键、二硫键 维系蛋白质分子的二级结构：氢键 维系蛋白质分子的三级结构：疏水相互作用力、氢键、范德华力、 盐键 维系蛋白质分子的四级结构：范德华力、盐键
a盐键（离子键） b 氢键 c 疏水相互作用力 d 范德华力
酶活性中心示意图
部分酶活性中心的氨基酸残基
酶 牛胰核糖核酸酶 溶菌酶 牛胰凝乳蛋白酶 牛胰蛋白酶 木瓜蛋白酶 弹性蛋白酶 枯草杆菌蛋白酶 碳酸酐酶 残基总数 124 129 245 238 212 240 275 258 活性中心残基 His12, His119, Lys41 Asp52, Glu35 His57, Asp102,Ser195 His46, Asp90, Ser183 Cys25, His159 His45, Asp93, Ser188 His46, Ser221 His93-Zn-His95 His117
5、多元催化 (multielement catalysis)


多元催化：多个基元催化形式的协同作用。一 般包括酸-碱催化，共价催化（亲核催化, 亲电 子催化）等。如凝乳蛋白酶：Ser-195亲核催化 ， His-57碱催化等； 酸-碱催化：通过暂时提供（或接受）一个质子 以稳定过渡态达到催化反应的目的；
第二章 酶反应的基本原理
提要：

一、酶的组成及其结构特点 二、酶的催化作用机理 三、酶的类型及命名

四、影响酶催化反应的因素
一、酶基本知识
1.酶的概念


酶：
生活细胞产生的具有特殊空间构像的,能进行 生物催化作用的生物大分子，包括蛋白质和核酸 两类物质，其中以蛋白质为主。

（1）酶与一般催化剂的共性
三、酶促反应动力学
初速度
产
酶促反应速度逐渐降低
物
0
时 酶促反应曲线
间
影响酶促反应速度的因素



底物浓度[S] 酶浓度[E] 反应温度 pH 值 抑制剂 激活剂
1 、底物浓度对酶促反应速度的影响
v
Vm
0.3 0.2 Vm 2 0.1 [S]与v关系： 当[S]很低时，[S]与v成比例-- 一级反应 当[S]较高时，[S]与v不成比例 当[S]很高时，[S]，v不变--零级反应
3
2 1 -4 -3 -2 -1 0
5
1/Vm=2.55 ; Vm=0.39
1
2
3
4
5
-1/Km=-2.8510
1/[S]
Km=3.51 10-6
2、酶浓度对反应速度的影响

反应速度与酶浓度成正比：当[S][E],式中Km可以忽略不计。
v= v
k3[E][S]
Km + [S]
=k3[E]
o
二、酶的催化作用机理
1、中间产物学说
E+S ES E +P
中间产物存在的证据：
(1) 同位素32P标记底物法（磷酸化酶与葡萄糖结合）； (2) 吸收光谱法（过氧化物酶与过氧化氢结合）。
2、诱导契合假说（induced-fit hypothesis） S
E-S复合物 S a b E c a b E c

+ _
活性中心内的必需基团： 结合基团(binding group)：与底物相结合的基团 催化基团(catalytic group) ：催化底物转变成产物的基团
结合基团 活性中心内 催化基团 的必需基团 酶活性中心

活性中心外的必需基团： 位于活性中心以外，维持酶活性中心应有的空间构象所必需。
结合部位:决定酶的专一性 催化部位:决定酶所催化反应 的性质。
溶菌酶酸、碱催化反应示意图
•共价催化（亲核催化, 亲电子催化）：通过催化剂与底物的 共价键结合，形成过渡态来加速反应。共价催化具有亲核、 亲电过程。 亲核催化：分别带有多电子的原子如O、S和N，可以提供电
子去攻击底物上相对带正电子的原子（如羰基碳），即所谓 的亲核攻击。 亲电催化：是由亲电试剂(具有接受电子对的原子)引起的 催化反应,是亲核催化的反过程．
[E]
3、温度对酶促反应速度的影响
产 物 麦 芽 糖 的 毫 克 数
2.0 1.5
1.0
0.5
0 10 20 30 40 50 60
℃
温度对唾液淀粉酶活性的影响 酶的最适温度: 酶活性最高时的温度, 也即酶的催化效率最高, 酶促反应速度最大时的温度。
4、pH对酶促反应速度的影响
酶 的 活 性
2
A
B
8 10 pH
pH对某些酶活性的影响 A: 胃蛋白酶; B: 葡萄糖-6-磷酸酶
酶的最适pH: 酶催化活性最高时的pH。
部分酶的最适 pH 值
酶 最适 pH
胃蛋白酶
过氧化氢酶 胰蛋白酶 延胡索酸酶 核糖核酸酶 精氨酸酶
1.8
7.6 7.7 7.8 7.8 9.8
5、抑制剂对酶促反应速度的影响
抑制作用: 直接或间接地影响酶的活性中心,使酶
0.20 0.40 0.85 1.25 1.70 2.00 8.00
5.0 2.5 1.17 0.80 0.58 0.50 0.125
0.150 0.200 0.275 0.315 0.340 0.350 0.360
6.66 5.00 3.64 3.17 2.94 2.86 2.78
1/v
7
6Baidu Nhomakorabea
5 4
用这些数据求丝氨酸脱水酶对磷酸吡哆醛的表观米氏常数。
解：1、v对[S]作图法:
v Vm 丙 酮 酸 M/20min 0.3 0.2 Vm 2
Vm=0.36 1/2Vm=0.18 Km=3.210-6 M
0.1
0 1
2
3
4 5
6
7 8 10-6 [S]
解2、1/v 对1/[S]作图法：
磷酸吡哆醛10 - 5（M） [S] 1/[S] 20分钟生成丙酮酸（M） v 1/v
用量少，催化效率高 不改变反应平衡点 可降低反应活化能

（2）酶的特性
高效性：以酶的转换数Kcat表示，mol底物 /mol酶.min mol底物/mol酶.min， 比非酶催化效率高107-1013 倍。 专一性：结构专一性（相对专一性/绝对专 一性） 立体异构专一性(几何异构/旋光 异构) 温和性（不稳定性）：酶催化需要的活化 能低，生物大分子，结构稳固性差。 可调控性：底物浓度、温度、pH、抑制剂 和激活剂等。 酶的Kcat为103-107
N
Glu35 COO CH2 OH R2 O H O OH R1 O O CH2 OH R2 CO2 CH2 Asp52 (CH2)2
Glu35 (CH2)2 COO H CH2 OH R2 O O OH R1 O O CH2 OH R2 CO2 CH2 Asp52
Glu35 (CH2)2 CH2 OH O R1 R2 COO R2 HO CO2 CH2 Asp52 OH O O CH2 OH
活化能：底物分子从初态转变到活 化态所需的能量。 能 量
非催化反 应活化能
一般催化 剂催化反 应活化能

活化态
酶的催化机理也是降 低反应的活化能、是 更大幅度地降低。 酶的催化效率通常比 非 催 化 反 应 高 108 ～ 1020 倍，比一般催化 剂高107～1013倍。

酶促反应 活化能
底物
反应总能 量改变
酶与底物相互接近时，其结构相互诱导、相互变形和相互适 应，进而相互结合。
3、趋近效应与定向作用（ proximity effect & orientation
arrange）
A
B
酶
底物和酶的活性中心结 合在一有限区域内互相接 近，趋近效应使底物在活 性中心的局部浓度提高数 干至数万倍，大大增加底 物互相碰撞的机会。
活性降低或丧失。
抑制剂：凡能降低酶活性而不引起酶蛋白变性的
4、Km值表示酶与底物之间的亲和程度：Km值大表示亲和程度 小，酶的催化活性低;Km值小表示亲和程度大,酶的催化活性 高。
•

米氏常数Km的测定：
斜率=Km/Vmax
1.0
测定Km和V的方法很多，最常用 的是Lineweaver–Burk的作 图法 — 双倒数作图法。 取米氏方程式的倒数形式：
1
0.8