植物体细胞胚胎发生

第六章植物体细胞胚胎发生
第一节体细胞胚胎发生特点及方式
一、体细胞胚胎发生特点
植物胚胎发生（Somatic embryogenesis）从合子开始。

自20世纪50年代末Steward等发现胡萝卜根细胞离体培养可通过体细胞胚胎发生形成再生植株以来，大量研究表明，大多数植物组织培养、单细胞悬浮培养、原生质体培养和花粉培养中都观察到体细胞胚胎发生或花粉胚胎发生。

其中体细胞胚为二倍体的体细胞产生的胚状结构；而花粉胚（Pollen embryos）是由小孢子或其分裂产物等单倍体细胞产生的体细胞胚，可发育成单倍体植株。

体细胞胚或花粉胚都起源于植物组织培养中一个非合子细胞，是经过胚胎发生和胚胎发育过程而形成的胚状结构。

体细胞胚是离体诱导过程中组织培养的产物，与无融合生殖胚明显不同，只限于组织培养范围使用；体细胞胚起源于非合子细胞，明显区别于合子胚；体细胞胚的形成经过胚胎发育过程，与组织培养器官发生途径中芽与根的分化不同。

植物体细胞胚胎发生和诱导器官发生相比具有明显的特点：
①具有两极性：在体细胞胚胎发生早期就具有胚根和胚芽两极性的存在，胚性细胞第一次分裂多为不均等分裂，形成顶细胞和基细胞，继而由较小的顶细胞继续分裂形成多细胞原胚，而较大的基细胞经过少数几次分裂成为胚柄部分，在形态上具有明显的极性，发育过程与合子胚相似。

体细胞胚一经形成，多数可生长为小植株，成苗率高。

因此，常将发育一定时期的体细胞胚制作成人工种子，以达到快速繁殖优良种质的目的。

不定芽和不定根则为单极性。

②存在生理隔离：体细胞胚形成后与母体植物或外植体的维管束系统较少连接，出现所谓生理隔离（Physiological isolation）现象，与器官发生途径完全不同（不定根或不定芽往往与愈伤组织的维管组织连接）。

③遗传性相对稳定：体细胞胚是由那些未经过畸变的细胞或变异较小的细胞形成，并可以实现全能性表达，通过体细胞胚形成的再生植株变异小于器官发生途径形成的再生植株。

正是基于体细胞胚的基因型与亲本相似，产生的后代植株表型也与亲本基本相同。

因此，体细胞胚可以制作成人工种子，不仅加速繁殖，且可保持优良种质的遗传稳定性。

器官发生途径再生植株一般要经过脱分化和再分化过程，诱导分化率和成苗率都较低，且芽和根的分化也需在不同条件下诱导，需要时间较长。

④重演受精卵形态发生的特性：植物组织培养形态发生的几种方式中，体细胞胚胎发生途径是最能体现植物细胞全能性的一种方式，因为它不仅表明植物体细胞具有全套遗传信息，而且重演合子形态发生的进程（转引自崔凯荣，戴若兰，2000）。

二、体细胞胚胎发生方式
植物组织培养过程中体细胞胚胎途径可分为直接途径和间接途径两类。

直接途径是指直接从原外植体不经愈伤组织阶段发育而成；间接方式是指体细胞胚从愈伤组织或悬浮细胞，有时也从已形成的体细胞胚的一组细胞中发育而成。

如香雪兰（Freesia refracta）花序外植体经直接体细胞胚胎发生途径形成再生植株（转引自崔凯荣，戴若兰，2000）。

直接发生体细胞胚胎的来源细胞可以是外植体表皮、亚表皮、幼胚、悬浮培养的细胞和原生质体。

一般认为直接方式发生体细胞胚是由原来就存在于外植体中的胚性细胞——预胚胎决定细胞（PEDCs）培养后直接进入胚胎发生而形成体细胞胚（Sharp WR，et al，1980），如柑桔属的珠心组织（体内或离体）可以通过预胚胎决定细胞直接进行体细胞胚的发生（Evans DA和Sharp WR，1981），而且是自然发生，有时甚至不需要借助外源生长调节剂的作用。

在体细胞胚再生植株表皮细胞中含有预胚胎决定细胞，可以在合适条件下直接进行体细胞胚胎发生，如胡萝卜和石龙芮等。

在间接体细胞胚发生过程中，起始培养基中生长素或生长素/细胞分裂素的浓度，对启动
已分化细胞恢复有丝分裂活性十分重要，而且对这些细胞成为胚胎发育状态的外遗传的重决定也很重要，之后这些细胞的胚胎发育还必须在诱导培养基上进一步 诱导。

间接体细胞胚胎发生中，外植体已分化的细胞先脱分化，并对进一步发育重新决定而诱导出胚性细胞——诱导胚胎决定细胞（IEDCs ），进而形成体细胞胚。

第二节 体细胞胚胎的起源和发育成植株的能力
一、体细胞胚的起源
体细胞胚胎发生的直接途径和间接途径均存在起源问题，即是起源于单细胞还是多细胞? 迄今为止，一直存在不同的看法，但绝大多数研究都认为体细胞胚胎起源于单细胞。

从多种植物中都观察到单个胚性细胞，有不均等分裂的二细胞原胚和均等分裂的二细胞原胚、多细胞原胚、球形胚直到成熟胚。

如木豆幼苗叶片愈伤组织悬浮培养体细胞胚的形成起源于单细胞，并且观察到体细胞胚发育的各个时期（见图 5.1）。

仙人掌科体细胞胚的发育也起源于单细胞（见图5.2）。

a —胚性叶片愈伤组织；
b —球形细胞；
c —伸长细胞；
d —两个细胞时期；
e —四个细胞时期；
f —原胚；
g —球形胚；
h —心形胚；
i —早期鱼雷胚；
j —成熟鱼雷胚；
k —不同时期的体细胞胚；
l —体细胞胚的萌发；
m —再生小植株
图5.1 木豆幼苗叶片愈伤组织悬浮培养体细胞胚的发育过程
（引自Anbazhagan and Ganapathi ，1999） a b c d e f g h i j k m
l
a —胚性细胞第一次分裂；
b ～d —原胚第一次细胞分裂，鳄梨树形胚柄细胞仍 保持单个细胞；e —胚柄细胞开始增殖；f ～k —原胚和胚柄 发育的不同时期；l —球形体细胞胚；m —成熟胚 （ep ＝原胚；s ＝胚柄）
图5.2 仙人掌科体细胞胚胎的早期发育（由单细胞形成球形胚时期）
（引自Rodriguez-Garay and Rubluo ，1992）
在同一块愈伤组织或一个胚性细胞复合体上，可以观察到一个或多个不同发育时期的体细胞胚（见图5.3和图5.4），从单个原始细胞到多细胞的原胚、球形胚、心形胚、鱼雷胚直至具子叶的胚状体，这是由体细胞胚发生和分裂的不同步所致。

王亚馥等在红豆草单细胞悬浮培养中也观察到体细胞胚的形成，单个胚性细胞具有明显极性，第一次分裂多为不等分裂，顶细胞继续分裂形成多细胞原胚，基细胞进行少数几次分裂形成胚柄。

有的研究观察到体细胞胚来源于多细胞组成的胚性细胞复合体。

王亚馥等也观察到这种胚性细胞团，但经同位素脉冲标记证明这些细胞团也是由一个单细胞连续分裂而成，经进一步分化和分裂形成不同发育时期的体细胞胚，因而这些体细胞胚实质上也可能起源于单细胞，当然也不排除有些植物的体细胞胚的确是起源于多细胞。

体细胞胚胎的发生是一个非常复杂的生理过程，仍有许多问题需进一步深入研究。

图5.3 香蕉心形体细胞胚 图5.4 可可心形胚A 和球形胚B
（引自Cirad ，2003） （引自Cirad ，2003）
二、体细胞转变为胚性细胞的机制
体细胞胚无论是起源于单细胞还是多细胞，都存在一个共同的问题，即体细胞如何转变为胚性细胞而形成体细胞胚。

大量研究表明，植物细胞在一定培养条件下，具体细胞胚胎发生能力可能是一个普遍现象。

植物体细胞胚胎发生实质上是细胞分化的问题，而细胞分化的分子基础则是基因差别表达与调控的结果。

有关细胞分化的分子机制有许多理论，其中最具普遍性的是渐变理论，认为一个细胞系的细胞质因子间的互相作用是一个原发稳定基因组中基因活化的结果，从而使该细胞系与其他细胞系不同。

这一理论认为细胞分化可以分为两个阶段，第一阶段为A
B
预决定阶段，细胞接受或预决定特殊发育，但并未表现出可见的特化标志，这种特性一旦建立，就可以在细胞继代培养中得以稳定保持；第二阶段是表达阶段，在适宜条件诱导下，体细胞胚发生预决定的细胞（Pro-embryogenic determined cells，PEDC）产生一系列生理生化和形态变化，表现出分化的特性，但由于这种表达与培养过程中诱导因素关系密切，因而表现为一种生理反应，是不稳定的（韩碧文，1989）。

这一理论在某种程度上可以解释体细胞胚发生的细胞学机制，但并未揭示体细胞胚胎发生的实质，以及细胞的预决定性是如何实现的；未能解释经多次继代培养的细胞往往会失去胚胎发生能力，因这一理论认为预决定细胞在以后的培养过程中处于稳定状态；不能解释体细胞胚胎直接发生途径和间接发生途径可因条件不同而相互转化的问题。

为了揭示体细胞胚胎发生的实质，应深入研究这些细胞在离体培养条件下细胞分化过程中基因差别表达与调控，克隆与鉴定相关的基因。

因此，需建立较为稳定、体细胞胚发生频率高、重复性好、细胞分裂同步化高、可控的相互转化的分化程序，并在形态或生理生化上提供用于鉴定体细胞胚胎发生的准确指标及相应的突变体等的实验体系。

按预决定观点，从外植体组织或细胞直接形成体细胞胚的途径需要一种诱导物的合成或抑制物的消除，以恢复有丝分裂活动和促进胚胎发育。

这时生长素对胚胎发生常起抑制作用，去除生长素并给以必要的条件，细胞就可进入分裂周期并进行胚胎发生的表达。

而从外植体经过脱分化形成愈伤组织，间接产生体细胞胚的途径，则需要分化细胞的重新预决定，被称为诱导的胚胎预决定的细胞（Induced embroygenically determined cells，IEDC）这时则需要生长素，诱导细胞进入细胞分裂周期。

生长素不仅是使细胞发生分裂所必需的物质，而且也是使细胞进入胚胎状态所必需的因素（韩碧文，1989）。

三、体细胞胚发育成植株的能力
一般而言，体细胞胚胎一旦分化出来或甚至完成诱导后，转移到基本培养基上即可发育成熟，并可形成小植株（见图 5.5）。

陈东方等（1986）对棒头草幼穗培养的研究表明，体细胞胚形成之后，可以在原来培养基或无任何附加成分的MS培养基以及加IAA或NAA 0.5mg/L和6-BA 0.5mg/L的1/2 MS培养基上萌发形成小植株。

体细胞胚萌发时，观察到两种不正常萌发现象，一种是不完全萌发，即只有芽而无根或只有根而无芽；另一种是早熟萌发，即在体细胞胚还未表现出完整的胚结构之前就已萌发，萌发时盾片膨大形成叶状体，在叶状体基部长出芽。

体细胞胚胎途径的形态发生能力要比器官分化途径保持更长久。

3
1—茎尖培养诱导形成胚性愈伤组织（MS培养基附加2.0mg/L 2，4-D）；
2—胚性愈伤组织悬浮培养增殖（MS培养基附加2.0mg/L 2，4-D）；
3—由细胞集合体形成体细胞胚（MS培养基附加2.0mg/L 2，4-D）；
4—体细胞胚萌发并形成小植株（MS培养基附加1.0mg/L ABA）
（比例尺R＝1.0mm）
图5.5 甘薯胚性愈伤组织诱导体细胞胚和再生小植株（品种栗子香）
（引自Liu, et al，1997，1998）
第三节体细胞胚发生生化基础及影响体细胞胚胎发生因素
一、体细胞胚发生的生化基础
近年来，随着植物生物技术的长足发展，人们对植物体细胞胚发生早已不局限于形态学和细胞胚胎学的直观描述，而是在此基础上，紧密结合细胞胚胎学过程研究生理生化机制，探讨体细胞胚发生的分子基础。

其中对体细胞胚形成过程中蛋白质和酶的动态变化的研究，为最终揭示体细胞胚发生机制奠定基础。

1. ATP酶活性的提高
研究表明，在枸杞的胚性细胞早期，ATP酶反应产物主要沉积于质膜和液泡膜上，尤其是在质膜上的ATP酶活性高，且呈连续分布。

胚性细胞后期，ATP酶活性从细胞质逐渐转入细胞内，在细胞质、液泡和细胞核中均有ATP酶活性反应，进一步表明ATP酶活性在胚性细胞发生过程中形成。

胚性细胞后期，细胞内部ATP酶被激活，表明细胞代谢活跃。

随着胚性细胞壁的加厚，细胞间隙和细胞壁上ATP酶活性的存在，可能为胚性细胞的分裂和发育提供能量，或者与物质和信息的传递密切相关。

2. 过氧化物酶和其他酶类
体细胞胚发生和发育是大量酶特异性合成及参与代谢的结果。

体细胞胚发生和发育过程中具有较高的过氧化物酶活性和较多的同工酶种类。

如过氧化物酶在小麦体细胞胚发生中起着重要的作用，尤其是C2、C6、C9三种同工酶带是胚胎发生的特异性酶带，被称为小麦体细胞胚发生的标志酶。

对大麦形态发生中几种酶的同工酶分析结果发现，过氧化物酶、酯酶和酸性磷酸酶同工酶的结合应用，可以作为体细胞胚发生的标志酶。

近年来在枸杞的体细胞胚发生中，发现超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD或POX）和过氧化氢酶（CAT）等几种抗氧化酶的活性在胚胎发生与发育过程中有特异性变化，表明体细胞胚发生也与超氧化物自由基的清除有关。

3. 体细胞胚发生过程中存在活跃的蛋白质合成，为体细胞胚发生和发育奠定分子
基础
有关体细胞胚发生中可溶性蛋白质含量的变化已有大量研究报道，尽管有些结果不尽相同，但变化趋势相近。

在各类材料中，胚性愈伤组织的可溶性蛋白质含量和合成速率远高于非胚性愈伤组织，表明前者代谢活性高于后者。

4. 体细胞胚发生中特异胚性蛋白质的形成
体细胞胚发生中不仅有蛋白质含量的变化，而且有特异的胚性蛋白质形成，推测这些胚性蛋白既可作为调控因子，又可作为结构蛋白、贮藏蛋白和酶蛋白而起作用。

20世纪80年代，在胡萝卜、水稻、玉米和豌豆等植物体细胞胚发生的研究中，发现有特异性蛋白质形成，而且在这些材料的胚性愈伤组织中，都存在45～55 kDa 的胚胎发生特异性蛋白质的合成。

在苜蓿体细胞胚发生中，发现有50kDa 特异性膜蛋白质表达，并作为苜蓿体细胞胚发生的分子标志（转引自崔凯荣，戴若兰，2000）。

5. RNA代谢动态
RNA的合成是胚性细胞发生的分子基础，也是体细胞胚正常发育的重要条件。

在体细胞胚发生和发育过程中，不仅RNA合成速率远高于非胚性愈伤组织，而且不同发育时期mRNA 种类不同，进而翻译形成多种蛋白质。

此外，这些种类丰富的mRNA的cDNA文库是研究胚胎发生与发育分子机制有效的分子探针。

Sengupta等在20世纪80年代初研究发现，胡萝卜
体细胞胚发生中RNA合成始于胚性细胞培养的2～4 h，两天后细胞分裂较快，总RNA和蛋白质含量增加，在胚性细胞中主要合成poly(A)＋mRNA，并认为它的出现是体细胞胚分化的重要遗传信息。

6. DNA代谢动态
DNA代谢动态与体细胞胚的形态学极性密切相关，它的合成为细胞分裂奠定物质基础，为细胞分化提供条件。

二、影响体细胞胚发生的因素
1. 植物激素与体细胞胚发生
（1）内源激素与体细胞胚发生
离体植物细胞开始时往往缺乏合成生长素和细胞分裂素的能力，但在大多数情况下，这些细胞的分裂和分化以及形态建成过程，又必须要有生长素和细胞分裂素两种激素的共同作用。

因此，在培养介质中添加不同种类或不同浓度的外源激素诱导形态发生已受到广泛重视。

但最关键的是组织内部和体细胞胚发生部位内源激素的代谢动态与平衡。

早在胡萝卜细胞悬浮培养体细胞胚发生中发现，2，4-D在诱导胚性细胞早期是必需的，而且2，4-D是通过影响IAA结合蛋白起作用，其实质是促进IAA结合蛋白的形成，提高细胞对IAA的敏感性从而诱导胚性细胞的形成。

在水稻细胞培养中也发现，由于2，4-D促进细胞内源IAA含量提高从而诱导胚性细胞的形成，并认为内源 IAA 含量上升或维持在较高水平，是胚性细胞出现的一个共同标志。

在小麦胚性愈伤组织诱导和分化过程中，胚性愈伤组织内源激素含量远高于非胚性愈伤组织。

此外，一些研究表明，ABA 对植物体细胞胚的发生与发育具有重要作用。

在胡萝卜体细胞胚形成过程早期，形成胚和未形成胚的细胞中内源 ABA 含量都维持在较低水平，但在培养第 10 天，形成胚的细胞中 ABA 含量上升到最高值，而后下降。

未能形成胚的细胞中 ABA 含量一直上升到第13天，而后下降，直至第 17 天降到最低值。

研究还表明，外源ABA与内源ABA对体细胞胚发生起到相互调节和促进的作用，而且通过补充提高外源ABA，可以明显提高体细胞胚发生的频率与质量。

（2）外源激素与体细胞胚发生
2，4-D是诱导多种植物离体培养体细胞转变为胚性细胞的重要激素。

在胡萝卜细胞培养中，加入2，4-D后诱导一些特异性多肽或蛋白质形成，当去除生长素后，这些多肽和蛋白质也随之消失。

但在诱导出胚性细胞后，及时除去培养基中的2，4-D，胚性细胞在进一步分化和发育的同时释放糖蛋白GP65（65kDa）（转引自崔凯荣，戴若兰，2000）。

以木豆幼苗叶片为外植体诱导获得愈伤组织，再进行悬浮培养产生体细胞胚。

在加有6.78 μmol/L 2，4-D 的固体MS培养基上，诱导原胚细胞形成的频率最高；将这种愈伤组织由该培养基转移到含有4.52 μmol/L 2，4-D的液体MS培养基上诱导，获得体细胞胚频率最高（见表5.1和表5.2）。

体细胞胚可以在无2，4-D的MS基本培养基上萌发。

不同生长素、细胞分裂素和碳水化合物对体细胞胚的诱导频率有影响。

在添加4.52 μmol/L 2，4-D和87.64 μmol/L 蔗糖的MS培养基上，体细胞胚诱导频率较高，但细胞分裂素对体细胞胚形成不利，
表5.1 在MS固体培养基上不同浓度2，4-D对
木豆幼苗叶片外植体诱导和原胚细胞形成的影响
（引自
并导致胚再次愈伤组织化（Anbazhagan and Ganapathi，1999）。

此外，2，4-D对紫花
苜蓿体细胞胚的诱导十分有效。

其他生长素如2，4，5-T也是很有效的。

生长素对体细胞胚形成的作用相当复杂（McKersie and Brown，1996），某些生长素如IAA和IBA对体细胞胚形成没有作用，但一直刺激胚性愈伤组织的形成，不能诱导体细胞胚。

培养基中的无机成分如钾和有机成分如脯氨酸，对胚性愈伤组织的形成具有调节作用，但不能取代生长素的作用（Shetty and McKersie，1993）。

表5.2 在具有不同浓度2，4-D的MS液体培养基上
木豆不同时期体细胞胚诱导频率
2，4-D （μmol/L）
收集细胞的
体积
（10th day）
体细胞胚发育时期
球形胚（%）心形胚（%）鱼雷胚（%）
0.00 0.0 0.0 0.0 0.0
1.12
2.8e 2.4e 1.8e 1.2e
2.26
3.2d 7.6d 2.4d 1.6d
3.38
4.6c 20.2b 8.2b
5.2b
4.52
5.2b 3
6.2a 20.4a 16.4a
5.64 5.6b 18.6c
6.6c 3.6c
6.78 6.2a
7.4d 1.6e 1.2e
（引自Anbazhagan and Ganapathi，1999）
不同2，4-D浓度和光照条件影响水稻顶端分生组织细胞体细胞胚的发生数量和发生率。

黑暗条件下，2，4-D浓度为10 μmol/L时，体细胞胚发生数量最多，发生率最高（见图5.6）。

图5.7为不同种类和浓度的生长素对不同品种花生胚轴体细胞胚诱导的作用。

此外，研究还发现，整个体细胞胚的发生可以分为需要生长素阶段和为生长素所抑制阶段（见图5.8）。

顶
端分
生组织每个细胞体细胞胚发生数量（柱形图）
顶
端
分
生
组
织
每
个
细
胞
体
细
胞
胚
发
生
率
（
曲
线
）2,4-D（μmol/L）
图5.6 培养两周后2，4-D浓度和光照条件对水稻顶端分生组织细胞体细胞胚发生数量和体细胞胚发生率的影响
（引自Duong，et al，2000）
A，C，E为离体培养6周后的体细胞胚；
B，D，F为离体培养5个月后形成的体细胞胚
A：品种GK7，在添加83.0 μmol/L centrophenoxine培养基上；B：品种AT120，在添加124.4 μmol/L centrophenoxine培养基上；C：品种59-4144，在添加12.4 μmol/L dicamba培养基上；D：品种AT120，在添加83.0 μmol/L dicamba培养基上；E：品种VC1，在添加83.0 μmol/L picloram培养基上；F：品种VC1，在添加124.4 μmol/L picloram培养基上。

比例尺R＝1 mm。

图5.7 含不同种类和不同浓度生长素固体培养基上
成熟花生胚轴体细胞胚诱导
（Little，Magbanua，Parrott，2000）
图5.8 胡萝卜悬浮培养细胞成为胚性和
非胚性状态的某些条件和途径
（引自Thomas and Wilde，1987）
2. 多胺（腐胺、尸胺、亚精胺、高亚精胺、精胺等）和乙烯与体细胞胚发生
外源多胺对体细胞胚发生的作用，除取决于植物种类及其内源多胺外，还与它们如何被吸收、运输和降解等问题密切相关。

多胺与体细胞胚发生的关系在胡萝卜的研究中较多。

研究发现胡萝卜胚性细胞中腐胺、精胺含量比非胚性的高，在胡萝卜体细胞胚发生的前胚时期多胺含量一般较低，从球形胚、心形胚到鱼雷胚时期，精胺和亚精胺含量逐渐升高，心形胚时期以腐胺为主，鱼雷胚时期则富含亚精胺。

研究表明，胚性细胞只在分化早期才与多胺生物合成关系密切。

此外，在胡萝卜愈伤组织的体细胞胚发生中发现乙烯抑制体细胞胚的发生，而乙烯形成酶抑制剂Ni2＋、Co2＋却可以促进其体细胞胚发生。

3. 糖类和金属离子与体细胞胚发生
糖类对诱导植物体细胞胚发生有重要影响。

在枸杞体细胞胚发生中，蔗糖浓度在3%～6% 条件下，体细胞胚诱导频率可维持在较高水平，但蔗糖浓度达到9% 时，由于影响细胞生长渗透势，抑制体细胞胚发生与发育，导致体细胞胚诱导率显著下降。

在木豆的研究中发现，在加有4.52 μmol/L 2，4-D和87.64 μmol/L蔗糖的MS培养基上，体细胞胚的诱导频率比其他处理要高（见表5.3）。

研究发现，小麦的愈伤组织一旦分化为胚性细胞后就有淀粉粒的积累，在胚性细胞分化与发育整个过程中，淀粉的两次合成高峰均在发育的重要转折期，为体细胞胚的进一步发育和分化提供必要物质和能量基础。

这表明淀粉的积累与胚性细胞分化能力和体细胞胚发育时期的转折密切相关。

茴香胚性细胞中也富含淀粉粒，在体细胞胚发育中同样出现两次峰值，同时认为淀粉出现的峰值与核酸和蛋白质合成密切相关，表明淀粉为蛋白质和核酸的合成奠定物质基础。

表5.3 在4.52 μmol/L 2，4-D培养基上不同碳水化合物
对木豆愈伤组织悬浮培养体细胞胚发生的影响
221.98 13.6c 7.2d 6.4d
果糖Fructose
55.49 6.2f 2.8g 2.4f 110.99 12.4c 5.2f 4.6c 166.48 6.4f 5.0f 4.2e 221.98 2.4h 1.2h 1.2g
蔗糖Sucrose
29.21 12.4c 6.8c 6.2d 58.43 20.2b 16.2b 14.6b 87.64 36.2a 20.4a 16.4a 116.86 12.6d 10.2c 8.4c
麦芽糖Maltose
27.75 2.4h 1.2h n.d 55.51 5.4g 2.6g 1.2g 83.26 1.2i n.d n.d 111.02 n.d n.d n.d
注：表中不同字母（a，b，c，d……）代表5% 差异显著。

（引自Anbazhagan and Ganapathi，1999）
金属离子对体细胞胚发生也有影响。

在小麦愈伤组织诱导体细胞胚发生中，发现Zn2＋、Cu2＋、Co2＋、Mn2＋等金属离子有重要促进作用，不仅提高诱导频率，且加速胚性愈伤组织的形成。

因此，在培养基中加入适当浓度金属离子可提高体细胞胚发生的频率（He，et al，1986）。

研究还表明，金属离子可能是通过促进多胺合成而提高体细胞胚发生频率。

4. 外植体
不同外植体体细胞胚发生能力不同。

如胡萝卜子叶不同部位培养诱导的发育过程不同（见图5-9），只有表皮下细胞才具有真正细胞全能性和有能力直接产生体细胞胚（胚胎发生区），而不用通过愈伤组织阶段的诱导。

表皮下细胞经过诱导直接形成体细胞胚，经过12天的细胞质生长和细胞分裂，开始进入四个细胞时期，14天后所有细胞完全进入四个细胞时期，经过18天形成球形胚，24天后形成心形胚，28天后形成鱼雷胚，再经过30天的诱导形成成熟胚。

而在子叶的根发生区细胞经诱导无体细胞胚发生，该区细胞经过2天细胞质生长和细胞分裂，开始有根原基发生，5天后根原基完全形成，7～10天后根开始发生。

芽发生区的细胞经过5天细胞质生长和细胞分裂，开始有芽原基发生，12天后芽原基完全形成，23天后开始分化芽，但没有体细胞胚发生（Li and Neumann，1985；Neumann and Grieb，1992；Neumann，1995）。

表皮下细胞根发生区细胞芽发生区细胞
图5.9 胡萝卜子叶不同部位外植体示意图
（Schäfer，et al，1985）
5. 光对体细胞胚形成的影响
光照影响大豆子叶体细胞胚的发生，而且不同品种对光的作用反应各异（见图5.10）。

品种Jack（光照强度50～60 µE m－2 s－1）。