常见重组蛋白纯化
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常见重组蛋白的纯化
前言:
近年来随着生物技术的进步,特别是基因工程的迅猛发展,表达蛋白已经变得很容易,相对而言,纯化却是一个非常繁杂的工作,所以越来越多的研究者把需要表达的目标蛋白和亲和纯化用的标签融合表达,这样纯化相对得比较容易,即使如此,由于蛋白的多样性,纯化依然是比较复杂而专业的工作,尤其对于不熟悉纯化的研究者而言,它成为一个项目的瓶颈,本手册就是把一些相关的材料汇集,希望对纯化重组蛋白有所帮助。
1.1 常见纯化的标签
理想的标签需要有以下的几个特点,1 最好能一步纯化得到纯品;2 对目标蛋白的结构和活性没有影响;3 方便切除标签;4 应用范围广,可适用各种表达系统或目标蛋白。
但是没有哪个标签是完美的,只能根据实际需要去自己筛选,下表是部分的标签以及纯化的方案:
由于篇幅有限,手册只只写多聚组氨酸标签、GST 融合蛋白。
2.组氨酸标签蛋白的纯化
His-Tag 融合蛋白是目前最常见的表达方式,而且很成熟,它的优点是表达方便而且基本不影响蛋白的活性,无论是表达的蛋白是可溶性的或者包涵体都可以用固定金属离子亲和色谱去(IMAC)纯化。
2.1I MAC(Immobilized Metal-ion affinity chromatography)是Porath et al.1975 年用固定IDA
作为配基的填料螯合过渡金属铜、镍、钴或锌离子,可以吸附纯化表面带组氨酸、色氨酸或半胱氨酸残基的蛋白,1987 年Sm ith et al. 发现带有几个组氨酸或色氨酸小肽和螯合金属离子的IDA-sephadex G-25 作用力更强,此前在1986 年他和他的合作者用Ni2+-IDA-sephadex G-25 亲和纯化在氨基端带组氨酸和色氨酸的胰岛素原。同年1987 年Hochuli et al.发现带有相连组氨酸的多肽和Ni2+- NTA填料作用力更强于普通的肽,1988 年他第一次用这样的方法纯化了带六个组氨酸标签的多肽,无论是在天然还是变性条件下一次亲和纯化都得到很好效果,此后表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC变得非常普遍,相对而言,不带标签的蛋白纯化就非常困难,所以表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC纯化变成最常用而且最有效的研究蛋白结构和功能的有力手段。
1986 年Porath et al.还发现Fe3+-IDA-sephadex G-25 可以用于磷酸化蛋白的纯化,而后发
现Ga3+-IDA也有同样的效果,这样螯合这两种金属离子的填料就有效用于磷酸化多肽的富集和纯化,同时IMAC也可以用于纯化各种和金属离子结合的多肽,应用非常广泛。市面常见的商品化IMAC 用于带六个组氨酸标签蛋白的配基有以下几种:
.2影响IMAC 纯化结果的因素:
2.2.1填料的种类:
不同填料厂家的填料有差别,所以使用过程最好能得到厂家的技术支持,因为不同的厂家填料不同,此外蛋白纯化个性很强,没有哪一个填料是能适合所有带六个组氨酸标签蛋白的纯化,载量高和特异性好本身就是矛盾。
2.2.2填料的配基种类、密度、金属离子种类
填料最简单的判断是螯合好同样的金属离子,哪家产品的颜色越深就意味着和蛋白的作用力越强,适用范围越广,载量也越高,纯化的好坏关键看纯化的条件,仅有填料的特异性是不够的,同样配基密度下IDA 填料的亲和力要比NTA 的强,所以NTA 上不能吸附的样品可以选择IDA 为配基的填料。
螯合金属离子和蛋白作用强弱为铜和镍离子的强,而锌和钴离子的弱。因此如果一个蛋白作用力强,想得到好的特异性可以选择螯合钴离子,它还有一个优点是不怕还原剂,特别时候有高浓度的还原剂。相同金属离子,IDA 的强于NTA。螯合金属离子的价位越低和蛋白的作用力越强。同时镍离子是最常用的,如果有条件可以换不同金属离子以得到更好的效果,因为不同的金属离子有不同的选择性。因此要希望填料应用范围广就选择镍琼脂糖凝胶,如果是希望特异性好而且稳定就选择镍NTA 琼脂糖凝胶.
2.2.2蛋白本身的结构和样品来源
IMAC 原理已经说明只要是带组氨酸、色氨酸或半胱氨酸残基的蛋白都可以被吸附,所以要想得到好的纯化效果,必须选择好纯化的条件,通常带组氨酸蛋白都可以在天然情况下被镍琼脂糖凝胶或镍NTA 琼脂糖凝胶吸附,但是如果标签折叠在蛋白内部不容易暴露,这样就难纯化,如果镍琼脂糖凝胶都不能吸附,可以在样品和平衡缓冲液中加1-2M 脲,这样蛋白结构相对松散,也许能吸附而蛋白不会变性,对于本身就是变性的蛋白如果8M 脲不能吸附,改用6M 盐酸胍溶解样品就可以被吸附,因为盐酸胍可以打开脲打不开的结构使得标签能暴露。当然如果有二硫键最好加1-2mMDTT 也可以更好解决吸附的问题。此外也可以把标签换到另外一端。
2.2.3缓冲体系,pH 及盐浓度
对于一些作用力弱的蛋白不能选择带氮原子的的一些缓冲体系,如Tris-HCl 等,适当提高缓冲液pH 可以增加吸附效果,同样原理可以降低pH 洗脱一些咪唑洗不去的杂带。为避免由于电荷作用的干扰,平衡缓冲液中需要加0.1-1M 氯化钠,而在平衡缓冲液添加00.1-0.5%吐温或者triton 可以降低由于疏水相互作用导致的非特异吸附。
2.2.4表面活性剂及其他添加剂
添加一些表面活性剂可以增加蛋白的溶解度,降低疏水相互作用,这样使纯化的结果更好,在实验表明在平衡缓冲液中加0.5-1%的吐温可以使电泳的背景更清晰,杂带减少。
对一些难溶解的样品也可以加乙醇或者甘油。在变性条件下有时会在样品中添加还原剂如巯基乙醇或者二巯基苏木糖醇,它们如果浓度过高或者上样量过大,会导致镍离子还原甚至脱落,使填料失效,如果要在这样的环境下,那最好选择螯合价位高的填料如镍
NTA 琼脂糖凝胶或降低还原剂的浓度,通常1-2mM 是没问题的。如果一定要选择高浓度的还原剂,也可以把镍离子还成钴离子,它不怕还原,把普通的镍琼脂糖凝胶还成钴离子即可。
以下是破碎及提取、纯化操作和常见问题解决方法:
破碎方法
样品的处理对纯化是很重要的,重要的原则是破碎要温和,不能使蛋白断裂或者降解,否则一些片段同样也带有标签,这样增加了纯化的难度。需要注意的问题是超声破碎温度,强度,时间
大肠杆菌的破碎方法:
1)收集培养发酵液,4 度7000-8000g 离心10 分钟,收集沉淀的菌体(如果不是马上破碎可以放-70 度冷冻,但是最好能保存成小块或者薄片,这样好用。) 2)取1-2 克菌体加10ml 破碎缓冲液(pH7.4 的50mM 磷酸缓冲液含0.5M NaCl,
0.5mg/ml 溶菌酶,1mM PMSF,1mM MgCl2,1.7units/ml Benzonase,其中的菌酶,
1mM PMSF,1.7units/ml Benzonase 现加)在冰上混合45 分钟,如果pH 不在7-8,
需要用0.5M NaOH 一边搅拌一边滴加.如果溶菌酶10mg/ml 混合时间可以缩短到10
分钟.
3)把混合菌体在冰水中用超声探头破碎20 秒种,总共四次,中间间隔要保持2 分钟冷却破碎液,检测pH,如果不在7-8,还是用0.5M NaOH 一边搅拌一边滴加去调.如果菌体
的为50-500 克,可以高压破碎的方法,缓冲液同上,体积为1 升,破碎三次,压力为800
bar.
4)破碎的液4 度12000g 离心10 分钟,如果要让溶液更澄清,可以4 度50000g 离心
30 分钟,这时候可以把上清和沉淀分别留样,跑电泳,如果只沉淀中有目标蛋白,
那就用变性条件下去提取。
5)破碎离心的上清加2M 咪唑溶液0.12ml 使终浓度为20mM,样品的总体积为10ml。
过柱子的样品最好过0.45μm 的滤膜,避免堵柱。
2.可溶性蛋白的纯化
1)平衡缓冲液:pH7.4 的50mM 磷酸缓冲液含0.5M NaCl,含20mM 咪唑。
2)洗脱缓冲液:pH7.4 的50mM 磷酸缓冲液含0.5M NaCl,含500mM 咪唑。
3)取1ml 镍琼脂糖凝胶FF 或镍NTA 琼脂糖凝胶FF 预装柱,用10ml 平衡缓冲液平衡,然后取破碎上清10ml 样品以0.5ml/min 上样,然后2ml/管分管收集。
4)用15ml 平衡缓冲液洗去未吸附的样品,流速1-2ml/min,2ml/管收集。
5)用5 ml 洗脱缓冲液洗去未吸附的样品,流速1-2ml/min,2ml/管收集。
6)再用5ml 平衡缓冲液平衡柱子,灌满20%乙醇,封闭,以备下次使用。
7)此方法是通用的方法,但是未必能得到适合自己蛋白的满意效果,所以优化的办法是洗脱可以用50mM,100mM,300mM,500mM 分阶段洗脱,各洗脱5 个柱体积,
这样配合电泳检测,得到适合自己的蛋白的条件。
8)收集的部分可以用紫外分光光度法、BCA 法或用考玛斯亮蓝法测定蛋白的浓度,再