肿瘤细胞耐药性与Keap1Nrf2P62的研究进展

肿瘤细胞耐药性与Keap1/Nrf2/P62的研究进展

【摘要】

肿瘤细胞耐药性是导致化疗失败及愈后不良的重要原因。在肿瘤治疗中，化疗药物作用于肿瘤细胞， Keapl/Nrf2通路上调, Nrf2及其介导的下游二相抗毒酶表达增高，是导致肿瘤细胞耐药性升高的重要机制。近年来有报导认为自噬通过促进肿瘤细胞产生凋亡抵抗从而产生耐药性。P62参与调节Keapl-Nrf2通路，影响了Keapl 的基础水平和Nrf2的基本活性，对肿瘤细胞耐药都具有重要意义。本文对肿瘤细胞耐药性与P62/Keapl/Nrf2通路的相互作用和分子机制进行综述。

【关键词】 Keap1；Nrf2； P62；自噬；肿瘤细胞耐药性

肿瘤严重影响着人类健康，目前人类已知的癌症种类已经超过200多种。通常情况下，化疗对于大多数癌症患者能取得较好疗效，但少数患者会走向难以治愈的耐药阶段，肿瘤细胞产生耐药性仍是目前肿瘤治疗中面临的一大难题。在反复多次使用化疗药物后，少数肿瘤细胞能抵抗化疗药物的杀伤作用而存活下来并不断增殖，导致患者肿瘤复发，这严重影响了癌症患者的生存质量。肿瘤细胞为了适应高氧化应激(ROS)的内环境，抗氧化能力会得以提升并可导致其耐药性增强。因此，研究肿瘤细胞适应这种氧化应激的相关机制，有助于寻找克服肿瘤耐药的途径。 肿瘤细胞产生耐药性是肿瘤化疗失败的关键因素。肿瘤细胞对于化疗药物的耐受性分为先天性耐药和获得性耐药。先天性耐药是指肿瘤细胞在未接触药物时，耐受相关因子就已存在肿瘤细胞内；获得性耐药则是接触药物后，肿瘤细胞内相关信号通路代偿性反应，某些基因或其表达发生改变，使得化疗效果降低。肿瘤产生耐药性的机制多而复杂，包括凋亡抵抗、细胞内药物泵出增强、核酸损伤修复能力增强、P 糖蛋白（P-gp ）表达增加、多药耐药相关基因（Mdr ）的表达增多以及活性氧(ROS)水平升高等。

1. 肿瘤耐药性与ROS ROS 是有氧代谢产生的一类活性含氧化合物的总称，主要包括超氧阴离子、羟自由基、过氧化氢和单线态氧等，ROS 能作为信号分子参与对肿瘤细胞增殖、分化和凋亡等多种信号转导途径的调控[1]

。在肿瘤的发生发展和恶化过程中，许多内源和外源性机制参与其中：肿瘤基因的激活、线粒体功能失常以及代谢异常等肿瘤细胞内部因素均可导致肿瘤细胞内ROS 水平的升高。最近，有学者指出细胞内ROS 水平轻度增高，能降低细胞内P-gp 的水平；而大量ROS 能引起细胞内的氧化应激，从而增加Mdr 的表达，进一步增加P-gP 的产生，肿瘤细胞获得耐药性状。在肿瘤细胞中，致癌基因一方面增加 ROS 的产生，当处于持续高水平的ROS 诱导状态下，肿瘤细胞提高自身氧化应激水平从而获得ROS 抵抗性，促肿瘤细胞存活，产生耐药性，以此来促进肿瘤细胞的增殖；另一方面刺激一些ROS 清除酶的表达发挥抗氧化机制，来最大程度上降低氧化损伤。通过激活 ROS 清除的酶系统来抵抗 ROS 的生成是肿瘤细胞抵抗氧化还原稳态的主要机制[2]。

肿瘤细胞抵抗氧化应激的平衡机制会诱导细胞内多种转录因子和信号通路发挥促细胞存活作用，并进一步导致肿瘤细胞耐药性的产生[3]，包括自噬、Keap1/Nrf2通路、Hif-1、硫氧还蛋白和 GSH 抗氧化系统等。例如，肿瘤细胞可以通过激活转录因子 HIF-1来应对 ROS 应激，增加糖酵解，促进细胞的存活[4]。化疗药物作用，肿瘤细胞ROS升高导致错折叠蛋白堆积引起内质网压力应激，肿瘤细胞通过诱导自噬降解错折叠蛋白，使得肿瘤细胞存活并产生耐药性[5]。在顺铂耐药的卵巢癌SKOV3 DDP细胞中, Keap1/Nrf2/自噬通过诱导下游相关的转录因子表达，从而避免了ROS刺激引起的细胞凋亡，细胞存活，获得耐药性[6]。因此，保持 ROS 的相对平衡对正常细胞的生长和生存十分关键,同时也表明破坏这种平衡机制可以成为治疗肿瘤的一个好方法。

2.肿瘤耐药性与Keap1/Nrf2通路

Keap1/Nrf2通路是细胞内防御氧化清除ROS 的一个重要机制[7]。人体通常会暴露在各种ROS刺激的氧化应激环境中，持续的氧化应激会造成细胞结构：脂质、蛋白质、核酸的损伤等，这些氧化损伤会诱发人体产生炎症、心血管疾病、神经变性性疾病甚至癌变[8]。细胞内参与抗氧化反应调节有三个主要细胞成分:Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1 (Keap1), 核因子NF-F2相关因子2 (Nrf2), 抗氧化反应原件(ARE)[9]。Keap1的N’末端BTB区是E3泛素连接酶的作用底物，可致使Nrf2泛素化并最终被E3泛素连接酶降解。Keap1的C’末端是DGR区，连接肌动蛋白，对Nrf2起锚定作用。Nrf2包含Neh1-Neh7七个功能区，位于Nrf2 C‘末端是七个亮氨酸拉链组成的亮氨酸拉链（bZIP），有助于其与ARE 的连接；N‘末端的Neh2区包含七个赖氨酸残基，负责和Keap1上C‘末端的Kelch区结合并锚定在肌动蛋白骨架上[10]。

Keap1/Nrf2/ARE通路调节细胞抵抗氧化应激，保持细胞维持在相对平衡状态，Nrf2为ARE介导基因表达的主要调控者，Keap1也被称为INrf2,对Nrf2发挥负调节作用[11]。Keap1/Nrf2/ARE通过上调下游各种细胞保护性二项抗毒酶来发挥最终的抗氧化作用，因为这些二项抗毒酶有相对较长的半衰期，如GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、醌氧化还原酶-1（NQO1），超氧化物歧化酶（SOD），谷胱甘肽S-转移酶（GST），谷胱甘肽过氧化物酶（GPx），血红素加氧酶-1（HO-1），谷氨酸-半胱氨酸连接酶（GCL）等[12]。

Nrf2和它的胞质接头蛋白Keap1则是细胞抗氧化反应的重要调节者。在面对外界应激压力时，细胞自我解毒以维持自身内环境的能力就显得尤其重要[13]。在正常情况下，Keap1将Nrf2固定在胞质的肌丝上，联合泛素化连接酶将Nrf2水解；一旦细胞受到亲电子或氧化物攻击，Keap1就会释放Nrf2入核，稳定的Nrf2进入核内与ARE原件结合，从而激活下游GAPDH、GCLC、NQO1、HO-1等一系列二项解毒酶的表达[14]。Keap1是如何释放Nrf2的具体机制还没有定论：1）Keap1与蛋白酶体泛素化连接酶连接，通过调节泛素化连接酶决定是否释放Nrf2 [15]。2）亲电子物质作用，Keap1与泛素化连接酶分离，使Nrf2不能被泛素化水解，Nrf2增多[16]。3）在人体受到亲电子或氧化物攻击时，Keap1中第27个半胱氨酸中的两个或更多个半胱氨酸残基可能作为次反应的关键感应部位调节Nrf2的表达，Nrf2会上调二项抗毒酶的表达。氧化物质通过与Keap1半胱氨酸残基反应，从而激活Nrf2通路[17]。Nrf2水平的上调促进癌症细胞的存活，从而有助于肿瘤细胞产生耐药性[18]。Adam Lister等认为，可以通过药理学水平控制Nrf2的水平和活性，以此来控制胰腺癌细胞的生长以及化疗敏感性[19]。简而言之，肿