DNA分子标记研究进展

DNA分子标记研究进展
第 7 卷第 1 期天津农学院学报 17, 11 N o V o l, 20002000 年 3 月 Jo u rna l o f T ian jin A g r icu ltu ra l Co llege M a rch () 文章编号: 1008- 5394 200001- 0021- 04
Ξ
分子标记研究进展 DN A
1 2 王晓梅杨秀荣 ( )1 天津农学院水产科学系, 天津 300384; 2 天津市植保所, 天津 300112
摘要: 分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的一种新的较为理想的遗传标记。

本文概述了几种主要的 DN A 分子标记的基本原理和特点, 同时对它们的优缺点进行了比较。

关键词: 分子标记原理特点
中图分类号: Q 75 文献标识码: A
遗传标记是基因型的特殊的易于识别的表现形式, 它是生物分类学、育种学、遗传学和物种起源与 1 进化等研究的主要技术指标之一。

理想的遗传标记主要应具备以下几条标准: ?具有较强的多态性;
() ?表现为共显性, 因而能鉴别出纯合基因型和杂合基因型; ?选择中性即无基因多效性; ?对主要的农艺性状无影响; ?经济方便和易于观察记载。

传统上一直沿用形态标记, 生物学研究进入细胞水帄后,
() 人们开始利用细胞标记作为遗传标记, 该标记是指染色体核型染色体的数目、大小、着丝粒位置等和
()带型带、带、带等。

随着同工酶技术的发展, 又广泛应用了从蛋白质水帄反映生物遗传差异的生 C G N
化标记。

这三种标记的数目有限, 往往不能满足研究的需要, 并且它们有些是基因表达加工后的产物, 其标记易受环境条件和发育阶段等因素的影响。

进入80 年代, 随着分子生物学及分子克隆技术的发展和完善, 诞生了直接从水帄上进行遗传分析的分子标记, 在人类基因组计划的推动下, 分子标记的 DN A 研究与应用得到了迅猛的发展。

分子标记直接以的形式表现, 不受环境条件和发育阶段的影响, DN A
标记的数目多, 多态性高。

并且有许多分子标记表现为共显性, 能提供完整的遗传信息, 当前分子标记已广泛应用于基因组研究的各个方面。

()1 限制性片段长度多态性 , R FL P R e st r ic t io n F ragm en t L en g th Po lym o rp h ism
R FL P 是 80 年代中期发展起来的一种最早的分子标记。

1980 年 Bo ste in 首先提出了利用 R FL P 作
为标记构建遗传图谱, 直到 1987 年 D o n is K e lle r 等人才构建出第一张人的 R FL P 图谱。

R FL P 是由于
分子中限制性内切酶酶切识别序列中出现碱基的插入、缺失、置换、倒位而导致酶切位点的增减所 DN A
2, 3 引起的基因型间限制性片段长度的差异。

它的基本原理是: 不同材料的用已知的限制性内切 DN A 酶消化后, 产生许多大小不等的片段, 电泳分离、印迹转移到硝酸纤维膜上, 用放射性标 DN A So u th e rn
记的探针与膜上变性的酶切进行杂交, 放射自显影, 即可显示出不同材料的多态性图谱, 即显示 DN A
出所分析的序列间的。

目前, 有 2 种方法可进行的分析。

一是上述原理
所述, DN A R FL PDN A R FL P
其中用作的探针可以是特殊基因的克隆、克隆、随机的基因组克隆和合成
的 R FL P DN A cDN A DN A
() 低聚核苷酸克隆。

二是对那些分子量较小的样本如线粒体、核糖体等, 可在酶切后 DN A DN A DN A 4 对其产物直接电泳, 将不同大小的限制性酶切片
段分离, 从而得到该的图谱。

DN A DN A R FL P
R FL P 标记呈孟德尔式遗传, 大多数 R FL P 的等位基因为共显性, 在任何
分离群体中能区分纯合基
Ξ 收稿日期: 1999211229 ( ) ) ( , 女汉族, 讲师, 硕士, 主要从事分子
生物学、组织学等方面的研究工作。

作者简介: 王晓梅 1962-
因型与杂合基因型。

标记的数目多且稳定, 可用于构建高密度的遗传图谱。

但
该技术在操作过程中涉及了的提取、酶切、电泳分离、探针的制备和杂交等一
系列分子生物学技术, 步骤繁杂, 工 DN A So u th e rn
() 作量大, 且分析中需要的量大 2, 10 , 因此在很大程度上限制了技术的
应用。

DN A ΛgR FL P
()2 随机扩增多态 , RA PD R an dom A m p lif ied Po lym o rp h ic DN
A DN A
是 1990 年由和领导的 2 个研究小组几乎同时发展起来的建立在基 RA PD W illiam s W e lsh PCR 5, 6 () 础上的一种新型的分子标记技术。

它的基本原理是: 采用随机合成的寡核苷酸通常 10 作 DN A bp
反应的引物, 对所研究生物基因组进行扩增。

一般说某一引物在真核基因
组中可能有 PCR DN A PCR
很多的结合位点, 但只有在 4 000 之内, 存在反向帄行的与该引物互补的双
链才能将合成的新 , bp DN A 链作下一次合成的模板, 经 35, 40 个循环, 即可得到大量的片段, 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳、 DN A
染色, 紫外下显示带纹。

EB RA PD
探针; ?使用随机引物, 合成引物时无需预知 RA PD 技术具有其自身独特的优点: ?不需要 DN A
被研究的生物的基因组序列, 一套引物可用于不同生物的研究; ?RA PD 技术
操作简便、快速, 可免去
中的克隆制备、同位素标记、杂交等步骤; ?分析所需量少, 每个反应仅需R FL P So u th e rn RA PD DN A
样本受限制的情几十纳克的 DN A , 仅为 R FL P 的1ƒ1 000, 1ƒ200, 这对生物早期取样鉴定或在 DN A 况下大有益处。

但 RA PD 技术也有自身的局限性, 主要表现在两个方面。

第一, RA PD 标记为显性分子标记, 因此不能在代区分纯合体与杂合体, 必须进行分析; 第二, 扩增中退火温度较常规的 F 2 F 3 RA PD 反应低, 一般为 36 ?左右, 这样能保证短核苷酸引物与模板的稳定配对并允
许适当的错配, 增大 PCR
了引物在基因组中配对的随机性, 提高了对基因组的分析效率, 但是由于采
用的引物短, 值DN A Tm
低, 扩增结果易受外界因素的影响, 实验的重复性较差, 因此在实验中要严格控制实验条件, 才能得到可
重复、理想的扩增效果。

()3 扩增片段长度多态性 , A FL P A m p lif ied F ragm en t L en g th Po lym o rh ism 7 是 1993 年由荷兰公司科学家等人发明的一种分子标记技术, 该技 A FL P k eygen e Zab eau DN A
术的基本原理是: 对基因组进行限制性酶切片段的选择性扩增。

主要步骤是: 将基因组进行DN A DN A
酶切片段的两端, 从而形成一个带接头的特异片段, 通过接限制性酶切后, 将特定的接头连接在 DN A
’ 头序列和引物 3端的识别, 进行扩增, 最终经过变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离, 通过银染 PCR PCR
或放射自显影检测。

技术实际上是将和相结合的一种技术。

该技术既继承了的稳定性, 又具 A FL P R FL P PCR R FL P
( )有反应快速、灵敏的特点, 同时克服了和的缺点, 且扩增的带纹多 50, 100 条。

PCR R FL P RA PD
的大多数扩增片段与基因组的单一位置相对应, 实验重复性高, 该标记为孟德尔式遗传。

但该技 A FL P
术目前在国内多用试剂盒来完成整个实验, 实验成本高; 此外该技术已申请专利, 目前人们只能自由地将该技术用于非赢利性的科学研究, 因此在某种程度上也限制了该技术的应用。

()4 简单序列重复 , SSR S im p le Sequ en ce R ep ea t
在真核生物基因组中, 散在分布着由 1, 4 个碱基对组成的简单重复序列, 即它又称为微卫星, SSR
()。

序列的侧翼具有保守的序列, 由于重复基数的数目变化大, 因此 DN A m ic ro sa te llite DN A SSR DN A
SSR 显示出较强的多态性。

人们把以微卫星 DN A 标记建立的遗传连锁图称为继 R FL P 作图后的第二代遗传连锁图。

1985 年已从人肌红蛋白位点获得了3 核心序列作探针, 与人的酶切后的总 Ieff rey s bp
体进行杂交, 得到了杂交带谱, 大多数带纹代表人基因组内不同座位上的卫星它们组合在 , DN A DN A 一起成为人的指纹图, 它有高度的个体差异, 且按孟德尔方式稳定遗传, 此法流行了近 10 , 在法 DN A a
8 医鉴定方面作出了贡献。

1993 年和改用小卫星探针显示带谱的方法, 创造了用侧W u T an k sley SSR
第 1 期 23? ?王晓梅, 等: DN A 分子标记研究进展
翼序列作引物的一部分, 用来扩增重复序列本身, 由于重复序列的长度变化极大, 因此是检测多态性的一种有效的方法。

该技术一般检测到的是一个单一的多等位基因位点, 此标记为共显性, 所得的结果重复性高。

为了提高分辨率, 常使用变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳, 它可检测出单拷贝差异。

该标记比 R FL P 8 的多态性更丰富, 且操作上比简便快速, 因此正在被广泛应用。

R FL P ()5 2 SCA R Sequ en ceC h a rac te r ized A m p lif ied R eg io n 标记是 1993 年在技术的基础上发展起来的。

基本流程是: 先作分析, 然后把 SCA R RA PD RA PD 目标的片段回收、克隆和测序, 再根据该序列设计特定引物, 此引物通常包含有原来的引 RA PD RA PD
9 物序列, 多为 20, 24 , 再用该引物对所研究的基因组进行扩增, 这样就可以把与原来 bp DN A PCR
的片段相对应的单一位点鉴定出来。

该标记为共显性遗传。

由于标记使用的引物长, 因而 RA PD SCA R
实验的可重复性高, 因此比和其它利用随机引物的方法在基因定位和作图中的应用要好。

RA PD
()6 2单链构象多态性 , SSC P S in g leS t ran d Co n fo rm a t io n Po lym o rp h ism
技术的基本原理是根据双链经变性处理后, 进行非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳, 由于SSC P DN A
可形成二级结构, DN A 分子在凝胶中的迁移率与其分子量和空间构型有关, 在非变性胶中, 单链 DN A 而这种二级结构与单链 DN A 的序列有关, 且单链 DN
A 的迁移率受到其二级结构的影响。

因此通过电
10 泳, 不同的单链被分离, 单链在凝胶中的位置差异反映了序列的差异, 所以 DN A DN A DN A SSC P
可以检测到点突变和多态性位点。

1993 年日本学者建立了技术。

它是将和技术相结合, 对 - T ak ao Sek iya PCR SSC P PCR SSC P
产物中的片段中的点突变进行检测, 它是用一对引物对基因组进行扩增, 对产 PCR DN A DN A PCR 物变性后, 通过聚丙烯酰胺凝胶分离, 来检测有无单链点突变。

该技术在癌症和遗传性疾病的突变位点 11 的检测中发挥了重要作用。

()7 2单核苷酸多态性 , SN P S in g leN u c leo t ide Po lym o rp h ism
同一位点的不同等位基因之间常常只有一个或几个核苷酸的差异, 因此从分子水帄上对单个核苷
片段的序列变化, 只能逐个克隆进行序列分析, 费时酸的差异进行检测具有重要意义。

过去检测 DN A
费力。

随着计算机和 DN A 芯片技术引入分子生物学领域, 研究者可同时对成千上万个克隆测序, 用计算机分析数据和显示最终结果。

1998 年科学家建立了技术, 目的是检测人类基因组中单个核苷酸 SN P
的改变。

利用制作的人类遗传图被称为人的第三代遗传图。

作为一种新的遗传标记, 几乎完 SN P SN P
全建立在芯片技术的基础上。

DN A
分子标记作为新的遗传标记, 具有比形态标记、细胞标记和同工酶标记显著的优点, 因此自分子标记诞生短短十几年的时间, 已发展了许多种分子标记技术, 尽管分子标记有许多优势, 但目前发现的任何一种分子标记均不能满足作为理想的遗传标记的所有要求。

上述列举的几种分子标记各有优缺点, 应用中应根据研究的需要及实验条件选择相应的标记技术。

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