糖尿病大鼠视网膜早期病变中PDGF(一)

糖尿病大鼠视网膜早期病变中PDGF(一)

作者：刘丽娟，李茂欣，汤旭磊，高林，朱任之

【关键词】糖尿病视网膜病变ExpressionofPDGFBinretinaofratswithearlystagediabeticretinopathy

【Abstract】AIM:ToobservetheexpressionofplateletderivedgrowthfactorBchain(PDGFB)mRNAintheretinaofdia beticratsattheearlystageofdiabeticretinopathy.METHODS:Atotalof60healthyadultmaleWistarratsw ererandomlydividedintocontrolanddiabeticgroups.Streptozotocin（60mg/kg）wasinjectedintothetailveintoinducediabetesin35ratsindiabeticgroup,while25ratsincontrolgroupw eretreatedwiththesamevolumeofcitricacidbuffersolution.Onthe3rddayafterinjection,theratswhos eurineglucosewasmorethan++andfastingbloodglucose≥16.7mmol/Lwerechosena slaboratoryobjec ts.Attheendof1st,2ndand3rdmonths,6ratsinbothgroupswererandomlysacrificedandtheretinaswer edissectedandtotalRNAwasisolatedforthedetectionofmRNAforPDGFBbysemiquantitativereversetr anscriptionpolymerasechainreaction(RTPCR).Theretinasoftheotherratsinbothgroupsweretakenan dpreparedastheultrathinandobservedbytransmissionelectronmicroscope.RESULTS:ThelevelsofmR NAencodingPDGFBintheretinasofdiabeticratsweresignificantlyhigherthanthoseincontrolsateachob servedtimepoint

（P0.05orP0.01attheendof1stand3rdmonth）.Obviousultrastructuraldamages,whichwereinrelati ontothecourseofdiabetes,couldbeseenintheretinasofdiabeticrats.CONCLUSION:Diabetesupregulat esPDGFBmRNAlevelsintheretinasofdiabeticratsinatimedependentmanner.

【Keywords】diabeticretinopathy；pericyte；plateletderivedgrowthfactorBchain；RTPCR

【摘要】目的：探讨血小板源生长因子B（PDGFB）mRNA表达水平在糖尿病(DM)大鼠视网膜中的变化规律及其作用.方法：雄性Wistar大鼠60只，随机分为正常对照组（25只）与造模组（35只）.造模组以链脲佐菌素(STZ)尾iv，3d后测定血糖≥16.7mmol/L，尿糖以上者定为DM大鼠.分别于造模成功后1，2，3mo末各组随机取6只大鼠，采用半定量逆转录聚合酶链反应（RTPCR）方法检测PDGFBmRNA在大鼠视网膜中的表达水平；电镜观察DM大鼠视网膜超微结构的改变.结果：随着病程的延长，视网膜中PDGFBmRNA表达水平在DM组明显升高，与正常对照组相比于造模后1mo末时即差异具有统计学意义（P＜0.05），3mo 末时差异显著（P0.01）；DM大鼠视网膜超微结构的损害随病程进展逐渐加重.结论：PDGFBmRNA在视网膜中的表达水平随DM病程进展逐步升高.

【关键词】糖尿病视网膜病变；周细胞；血小板源生长因子B；逆转录聚合酶链反应

0引言

视网膜周细胞的渐进性功能丧失及死亡为糖尿病(diabetesmelitus,DM)视网膜病变（diabeticretinopathy,DR）的早期典型病理特征.周细胞对于保持微血管形态与功能的完整都有重要作用，缺乏周细胞将导致内皮细胞增生及血管形态异常〔1〕，并且促使DR进展〔2〕.血小板源生长因子B（plateletderivedgrowthfactorB，PDGFB）是周细胞最重要的生长因子，与周细胞表达的受体PDGFRβ结合维持着周细胞的密度和数量.PDGFB可以显著减少因缺血缺氧导致的周细胞死亡、减少缺氧对体外培养的视网膜微血管的损害〔3〕.因此，探讨PDGFB 在早期DR中表达的变化规律及其作用，可为DR的早期检测、防治提供理论依据.

1材料和方法

1.1材料

雄性Wistar大鼠60只，体质量(200±20)g，由兰州军区总医院实验动物中心提供；链脲佐菌素（streptozotocin,STZ）（美国Alexis公司）；Trizol（BBI产品）；罗氏血糖仪及试纸条；PDGFB 的引物为：5＇CGCTCCTTTGATGACCTTC3＇,5＇GCACTCGGCGATTACGG3＇（长177bp），βactin

引物为：5＇GAGGGAAATCGTGCGTGAC3＇,5＇GGAGCCAGGGCAGTAATC3＇（长351bp），由大连宝生物公司合成；Takara一步法RTPCR试剂盒；PE2400型PCR仪（AppliedBiosystems公司）；UVIpro凝胶成像与分析系统（华粤公司）.

1.2方法

雄性Wistar大鼠60只，体质量(200±20)g，随机分为正常对照组（25只）与造模组（35只）.造模组禁食12h后，将STZ以0.1mol/L，pH4.4柠檬酸缓冲液溶解配制成20g/L的溶液后以60mg/kg一次性尾iv，正常对照组仅注射等体积的柠檬酸缓冲液.3d后尾静脉采血测定血糖≥16.7mmol/L，尿糖以上者定为DM大鼠，分笼喂养，以后每2wk称体质量、测血糖2次取均值.DM组和对照组大鼠均喂养普通颗粒饲料，实验期间自由摄食饮水，自然昼夜照明.于造模后1，2，3mo末DM大鼠组随机取2只大鼠用作电镜观察.摘取眼球、剥离视网膜组织切成15mm×15mm的小块,25g/L戊二醛固定2h,10g/L锇酸后固定1h,梯度乙醇脱水,环氧树脂包埋,聚合LKB超薄切片机切片,醋酸双氧铀及枸椽酸铅双重染色,于日本JEM100CX透射电镜下观察.分别于造模后1，2，3mo末各组取大鼠6只，称体质量、测空腹血糖后处死轻摘眼球，剥离视网膜，每2只眼为一组，将分离的视网膜置于去RNA酶的冻存管中，液氮中保存待用.Trizol提取视网膜总RNA，测定纯度及含量，10mL/L甲醛变性凝胶电泳测定其完整性.按Takara一步法RTPCR试剂盒说明操作，反应条件均为逆转录过程50℃30min；94℃预变性3min；扩增94℃30s;50℃30s;72℃1min;30个循环；72℃延伸7min.PCR产物以15g/L琼脂糖电泳.以UVIpro凝胶成像与分析系统检测电泳结果，以PDGFB与βactinPCR产物DNA条带的像素亮度总和之比作为反映PDGFBmRNA水平的相对指标.

统计学处理：数据用SPSS10.0进行统计学分析，采用成组设计资料两样本均数比较t检验,结果以x±s表示.P＜0.05表示差异有统计学意义.