单分子测序技术在靶基因组测序及表观遗传学的应用 第三代测

对未知基因组测序。

以单分子测序系统PacBio RS 为代表的第三代测序技术，是一种模拟天然DNA 复制过程的测序技术，不仅融合了天然DNA 复制高效准确的特点，而且是世界上唯一可以在不影响聚合酶活性的前提下实时观察DNA 合成的测序技术。由于聚合酶的平均反应速度可达1个碱基每秒以上，因而其测序速度比Sanger 测序快了几万倍。参与三代测序技术研发的Korlach 与Turner ，于2009年2月在《Science 》杂志上发表了一篇介绍PacBio 单分子DNA 测序技术的文章，代表了首个第三代测序技术的“原理验证”[2]。其后，他们又利用SMRT 技术，直接测定了DNA 的甲基化，这一发表在2011年5月《Nature Methods 》上的研究成果，相对于目前流行的第二代测序技术显然又前进了一大步

[3]

。PacBio RS 单分子测序系统目前的读长超过1kb ，比第

二代测序要长得多，且不需要常规的PCR 扩增过程，错误率也大大降低，聚合酶动力学的直接观察赋予了PacBio RS 系统在测序之外的更多应用（表1

）。

单分子测序技术在靶基因组测序及表观遗传学的应用

第三代测序技术

DNA测序技术的变革

DNA 测序技术，不仅为基因组计划揭开了基因密码的神秘面纱，同时在诸如肿瘤及遗传性疾病治疗的医药行业、材料科学行业、石油替代物研发的生物燃料行业、产能更高的种植业和畜牧业等领域都有着重要的应用价值。

测序技术最早可以追溯到20世纪50年代，即1954年出现的关于Whitfeld 发明化学降解测序法的早期测序技术报导。但从严格意义上讲，直到1977年Sanger 等的双脱氧核苷酸末端终止法和Gilbert 等的化学降解法的诞生，才标志着第一代测序技术的确立。尽管在完成从噬菌体基因组到人类基因组草图绘制等大量测序工作中，第一代测序技术充分展示了可靠、准确等优点，但其对于电泳分离技术的依赖及成本高、耗时长等局限性也日益显现，试想绘制一张人类基因组图谱需耗费数年时间显然无法满足临床科研的紧迫需要。

进入21世纪，诞生的第二代测序技术（NGS, next generation sequencing ），不仅保持了第一代测序的高准确度，而且大大降低了测序成本并极大地提高了测序速度，可将完成一张人类基因组图谱的时间缩短到一周左右的时间，因而在2007年高票当选《Nature Methods 》生物领域最有影响力技术[1]

。第二代测序技术最大的缺点在于测序读长过短，其产生的大量短测序结果，犹如一堆拼图碎片，往往难以进行拼接以获取测序基因组全貌，多数情况下仍须结合第一代测序技术来进行序列的重新测序和结果拼接。可见，牺牲了读长的高速二代测序技

术更适合对已知序列基因组的重新测序，显然不适用于

表1. 一代、二代和三代测序技术的对比情况

PacBio RS系统的技术创新

天然的DNA复制是一个相当微观且高速的过程。Pacific Biosciences（以下简称PacBio）公司在克服了酶学、表面化学和检测光学等一系列技术难题的基础上，研发出了单分子测序系统PacBio RS，它可在不影响DNA聚合酶活性的前提下实时地观察DNA合成。

首先，实时观察DNA聚合酶需要解决的酶学难题是如何维持DNA聚合酶的高活性。因为传统的核苷酸标记方法是将荧光标记连接到核苷酸的碱基上，也就是掺入DNA链中。由于DNA聚合酶的直径只有15nm，大分子的荧光染料掺入DNA链会干扰DNA聚合酶的活性，造成聚合反应提前终止，影响了测序反应进程。PacBio RS系统采用了一种新型的核苷酸标记方法，即在核苷酸的磷酸链上进行荧光标记，这样一旦核苷酸掺入到新生DNA链中，DNA聚合酶将磷酸基团及其所带的荧光标记一并切除以形成天然DNA链。此后，脱落下来的荧光信号迅速衰减至基线并开始下一轮的合成反应。此标记方法不仅不会影响DNA聚合酶活性，同时游离的荧光信号迅速衰减以降低背景噪音，有利于提高检测过程的信噪比。

其次，实时观察DNA聚合酶需要克服的表面化学难题是如何实现单个DNA聚合酶分子在基质表面的锚定和DNA合成反应。PacBio RS系统的测序是在专利的SMRT Cell中进行的，每个Cell中都有一个矩阵，上面有大约150,000个纳米级的ZMW（zero-mode waveguide，零模波导孔）。ZMW是一个直径为几十纳米的小孔，在每个ZMW中，利用专利技术将带有单条DNA样品链的单个DNA聚合酶分子锚定在底部玻璃的表面。随后核苷酸涌入ZMW中，并在阵列表面扩散。当DNA聚合酶检测到正确的核苷酸时，便将其掺入新生链中进行DNA合成反应。每个SMRT Cell能够平行检测至少50,000个单分子测序反应。

再次，实时观察DNA聚合酶需要破解的检测光学难题是如何能在DNA合成期间检测到单个核苷酸的掺入。试想当显微镜实时记录DNA链上的荧光时，周围众多的荧光标记核苷酸会形成非常强大的荧光背景噪音，影响了单分子荧光的检测和记录。PacBio RS系统采用纳米级直径的ZMW，可阻止波长约为600nm的可见激光完全透过ZMW，造成可见激光在进入ZMW后迅速衰减，保证了只有底部30nm被照亮（图1）。单个ZMW中，锚定在其底部的单个DNA聚合酶分子可检测扩散在其周围的荧光标记核苷酸，正确的核苷酸掺入新生链的过程需要几毫秒，而单纯的核苷酸扩散只需要几微秒。这种时间差使掺入的核苷酸产生了类似于脉冲信号的高强度信号，该信号随后被转换成相对应的碱基类型。因此，ZMW有能力在荧光标记核苷酸的背景下检测到单个核苷酸的掺入事件。至于检测信号的记录，PacBio RS系统使用一个大孔径物镜和四个单光子照相机来收集单个ZMW中荧光所发射的光脉冲，实时开展、监控并分析单分子生化反应；并使用一套优化的算法，将光学系统所捕获的信息翻译成ACGT碱基。一旦测序开始，实时的数据就传送到初步分析流水线，生成核苷酸信息和质量值。

基于以上酶学、表面化学和检测光学三种技术的完美融合，使PacBio RS系统在较短的时间内实现对长片段DNA的测序。另外，PacBio RS系统不仅提供全套的测序试剂和仪器配置方案，还自带有一级、二级数据分析软件，可与用户的生物信息学平台实现无缝整合，轻松实现测序数据浏览、数据过滤和比对、诸如单核苷酸多态性（SNP）等稀有突变的可视化筛查等数据分析操作。凭借较少的试剂消耗、简单的样本制备过程，低于一天的检测时间（从样本制备到测序）等一系列技术优势，使PacBio 公司被美国麻省理工学院（MIT）的《Technology Review》杂志评为2010年度全球50家最具创新力的企业之一。

PacBio RS系统在靶基因组测序中的应用

PacBio RS系统在微生物、植物、动物的靶基因组测序中的应用，可以以一个最简单的微生物基因组为例，因为典型的微生物基因组一般为200-500万碱基，而通常一个PacBio RS系统的SMRT Cell可产生90Mb、读长为35,000的测序数据。采用平均读长为2700bp及5%大于6000bp的读长，PacBio RS 系统可测通一个微生物基因组。此外，

图1. ZMW的检测光路图