金属硫蛋白检测方法研究进展1

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中国食物与营养
2010年第09期Food and Nutrition in Chi na No.09,2010
金属硫蛋白检测方法研究进展
梁鹏,吴晓萍,廖爱琳
(广东海洋大学食品科技学院,湛江 524025)
摘要:金属硫蛋白是一种富含金属和半胱氨酸的低分子蛋白质,主要包括Ag、Au、Bi、Cd、Hg、Zn等硫蛋白,具有在体内可被金属和其他因素诱导合成的生物学特性。

本文综述了目前7种常用的金属硫蛋白检测方法。

关键词:金属硫蛋白;金属结合法;电化学法
金属硫蛋白(Metallothionein,简称M T)是一类广泛
存在于生物体内的低分子量(约6500D a)金属结合蛋白,富含半胱氨酸,又叫金属硫氨酸甲基内盐,能被金属诱导。

主要存在于动物的肝脏、肾脏、胰腺和小肠中。

近年来,很多实验表明,金属硫蛋白参与体内微量元素的储存、转运和代谢,具有拮抗电离辐射、清除自由基以及对重金属解毒的作用,还与机体生长发育、延缓衰老及某些疾病有关。

到目前有几种方法已用于生物组织和体液中M T的定量,但尚无标准方法。

本文重点综述7种方法,介绍其特点,有助于在进行有关研究时选择和建立适宜的检测方法。

1 金属结合法
金属结合法(Metal bindin g )主要基于M T对金属的高亲合力、且不同金属的亲合力具有差异性及其热稳定性而建立。

主要通过测定M T结合金属—竞争性替换金属含量来检测M T中金属含量的增高,从而计算出MT的含量。

1973年,P i o t r o w s k i等首先建立了金
属结合法 (203H g-T C A法)用于测定组织中的
M T。

由于H g2+在酸性环境下不仅可与M T结合而且还可置换其他金属离子(如p H=2.1时,分别有98%的H g2+和1%的C d2+与M T 结合)。

因此,本法适用于在利用酸沉淀其他蛋白而将M T分离出来时的测定[1]。

但此法的203H g
的加入量极其重要,如加入量过小,反
应体系中尚有未与203H g结合
的MT,而导致测定结果偏低;相反,
加入量过大, 则203H g呈游离状态或与不被T C A所沉淀的低分子量组分相结合,又可使测定结果偏高。

作者:梁鹏(1985~),硕士研究生,研究方向:食品质量与安全。

通讯作者:吴晓萍
张保林等[2]运用银饱和分析法结合原子吸收光谱(A A S)检测了兔肝Z n-M T,具体方法为:向含M T的
溶液中加入过量的A g+,待反应完全后,再逐
次加入血
红蛋白,以结合剩余的A g+,加热使血红蛋白
沉淀,
与M T结合的A g+则完全存在于上清液中,通过A A
S测定其中A g+含量,便可计算出M T的浓度。


方法与其
他方法比较,不需要去除样品中共存的其它
蛋白质和
含S H基剂,可直接计算出M T含量,且不需特
殊的仪
器设备,操作简便,具有很高的重复性和准
确性,该
法检测的᳔低限为1μg/ml。

金属结合法具有一定的缺陷,如H g饱和法中
H g+
除与MT结合外, 还与其他一些小分子量化合物
结合;
A g+不能置换已与M T结合的H g,且由于利用金属
含量间接推算MT含量,特异性较差。

2 电化学法
电化学方法(Electrochemical )是利用巯基(-SH)
在汞滴电极表面产生氧化还原反应出现的电
位变化建
立的,通过测定巯基以计算M T的含量。

运用检
测M T
的电化学方法有:示差脉冲极谱法(DPP)、微分
脉冲极
谱法、示差脉冲阳极溶出伏安法(DPASV) 和循环
伏安
法(CV)等。

1979年Olafson等建立了示差脉冲极谱
法[3]
测定M T,检出限为10-8M,且不受分子中金属含
量的
影响。

因此, 此法或许更能特异地反映MT而不
是金属
的量。

1992年,Bebianno等人应用差分微分脉冲
极谱
法测定了贻贝组织中MT的浓度[4];后来B ordin等
通过
改变体系的p H值,利用D D P方便的检出了多种形
式的
MT,并快速分析出还原型的MT;Bebiann应用微
分脉
梁鹏等:金属硫蛋白检测方法研究进展57 冲极谱法测定了贻贝整个软件组织中的C d-M T浓度。

铁峰[5]报道用电化学分析仪单扫极谱法测定-S H基含
量,李明春[6]采用组织化学方法,用简化的巯基试剂(DTNB)测定-SH含量。

3 免疫法
免疫法具有灵敏、特异的优点,所以近年来许多学者们建立了放射免疫分析法(RIA)和酶联免疫吸附分析法(ELISA)用于MT的检测。

Mallie等人于1979年首先应用RIA检测大鼠血清中的M T。

此方法的检测范围在0.1~100n g/m l之间,但此方法要用到放射性同位素,另外需时过长(3d),给常规检测带来不便。

1986年T h o m a s等首先建立了E L I S A,测定速度快、无需接触放射性同位素,与R I A无显著差异,灵敏度可达100pg/ml,与RIA相似,但ELISA的测定相对迅速,且无需昂贵的仪器设备和接触放射性同位素。

郑军恒[7]等于1999年用E L I S A法测定人血液中的M T,直接型ELISA检测范围为1~10ng,竞争性ELISA[8]检测范围为50~500ng。

随后Anderse等人采用二抗改进W estern Blotting法检测MT,检测限可达1ng。

任宏伟[9]等用ELISA测定鱼类体内的MT,结果表明比金属Cd血红素饱和法具有更高的特异性,检测范围为10~40ng/ ml;黄波[10]等用竞争型ELISA法测定人尿中的MT,检测限为20n g/m l。

对免疫检测方法,有学者[11]认为M T 具有较多的二硫键易被氧化,从而使共免疫性发生改变,进而影响免疫法的测定结果。

4 色谱分析法
对 M T 中不同亚型的检测,色谱分析法(L a w chromatography )较为适合, 应用的色谱分析法主要有H P L C 、R P H P L C 、H P L C -I C P -M S 、H P L C -A A S 。

Hu nziker等[12]使用RP HP L C从兔组织样品中分离出7种亚型, 通过A A S来检测样品的金属含量,对M T定量测定。

鉴于常规色谱层析法分辨力差, 洗脱费时,Suzuki 使用凝胶渗透柱的H P L C将C d诱导大鼠的肝组织样品的M T分离出来,经直接联于A A S来检测样品的金属含量,对M T定量测定。

本法可在1h内检出浓度小于1μg/ml的1ml上柱样品中的MT含量,而且,可分别测定不同型的M T。

J i n等[13]利用H P L C分离M T,然后根据样品对250n m紫外吸收特性来直接对M T定量。

该法的灵敏度小于1μg/ml。

5 蛋白质印迹分析法
1986年,Aoki等利用蛋白质印迹分析法(W ester n
Blotting Analysis)检测MT,检测限为0.6n g, 不仅可检测M T,而且可检测其它与镉结合的蛋白质。

随后,A ndersen等建立了以兔抗鼠MT抗体为一抗,过氧化物酶联羊抗兔IgG为二抗,4-氯-萘酚作显色剂的蛋白质印迹技术用于检测M T,其检测限可达1n g[14]。

本法主要用于M T同分异构体的特性以及M T与各种金属离子相互作用的研究[15]。

6 巯基显色法
巯基显色法(SH Color Code )适合于检测MT含量较高的样品,对含量较低的样品灵敏度较差。

李立丽等 [16]用Z n S O4诱导猪肝产生M T,然后将M T粗提液加入巯基试剂(1:1),在分光光度计420nm处读取吸光度A 值。

用自制的M T纯品制作标准曲线,根据A值可在标准曲线上读出M T浓度。

诱导后的猪肝中因M T 含量较高采用其它方法均不能灵敏地进行检测,相对而言更适合采用巯基显色进行检测,并且巯基显色法操作简单、特异性较好,又可以避免放射性接触。

7 偶联技术
金属饱和分析对单一M T亚型缺乏选择性:免疫学分析不能定量混合物中单一M T亚型,不能给出原始金属组成,根据UU信号或染色定量灵敏度相对较低, 不能测定非诱导M T s。

若将高效分离技术和灵敏特异的选择性检测器联合起来,将是一种理想的MTs 检测策略。

᳔近发展的电喷离子化M S、碰撞诱导分离(C I D) M S和离子喷射源加强片段分别根据分子量、氨基酸序列、金属含量给出MT的详细特征。

偶联技术(coupled
techniques )是快速灵敏、全面定性定量生物标本中MT
亚型的一种᳔具吸引力的工具,未来能有效代替金属饱合分析、免疫分析而进入生化和临床实验室[17]。

高效的分离技术与灵敏的检测技术“杂交”形成的偶联技术,恰能克服以前各种方法的缺点,快速、有效测定M T。

因此,偶联技术的应用与发展,必将成为未来MT检测方法的发展方向。

综上所述,灵敏性(即᳔小检出量)是选择检测MT 方法的一个重要指标。

因而测定组织器官中的M T的含量,首推HPLC-AAS法,测定体液(如血液、尿液等)中的M T含量,选用RIA和ELISA法为佳。

每种检测方法其结果
58 中国食物与营养
都可能会受到某些因素的影响:(1)样品的处理方法;
(2)MT结合金属的种类;(3)MT同形体的
多态性;(4)大量MT蛋白和非MT蛋白中MT的高
比例等。

金属结合法适于测定M T含量较高的样品;
H P L C 适于分离和检测M T的同分异构体,此外,
电化学法和
蛋白印迹分析还可用于研究M T的构型变化
及其与金属
离子相互作用的关系;免疫法则适于检测M T含量较低
的样品;M T检测方法需要标准化,对所测
得的结果作
出适当的解释,如所测得的M T是总量还是
其中的一种
类型或亚型,或者是氧化状态还是还原状态,有待进一步探讨。


参考文献
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Advancement of Metallothionein Detection Methods
LIANG Peng,WU Xiao-ping,LIAO Ai-lin
(College of food science and technology,Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524025)
Abs tract:Metallothionein was a kind of low-molecular-weight protein rich in metals and 2-amino-3- thiopropionic acid such as sulfurprotein with Ag,Au,Bi,Cd,Hg,Zn,etc., which had biocharacteristics of been indued s ynthesis by metals and other factors. Seven methods to detect MT were discussed in the paper.
Keywords:Metallothionein;Metal-binding Method;Electrochemical Method。

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