流式细胞术实验方法及应用

收集胸水、腹水、尿液、冲洗液 置 ℃ 冰箱中 沉淀 取底部 洗 次 目尼龙滤网过滤 单细胞悬液
收集方法、沉淀时间 胸水、腹水：胸、腹水，加入 肝
素液，置于℃ 冰箱中静置 尿 液：收集 尿液，置℃冰箱中自然沉淀 冲洗液： 生理盐水冲洗膀胱 ，冰箱内置
五、荧光标记 主要包括间接免疫荧光染色和直接免
疫荧光染色两种方法。 间接标记是采用特异的无荧光标记的一
时标记，首先标记表面抗原，然后再对细胞膜和 核膜进行固定破膜后再标记胞内或核内抗原。 常见细胞破膜剂： 皂角素、曲拉通 ( )、乙醇、 商品化固定破膜剂（、）。
六、荧光染色对照设置(空白对照 、阳性对照、 阴性对照、
同型对照 )
、空白对照 用缓冲液（）代替单克隆抗体进行实验
、阳性染色对照 用现有试剂和方法检测已知表达某种特异 性抗原的细胞即为阳性细胞。如检测血小板时，可用被 诱导活化血小板作为检测的阳性对照细胞。
、骨髓及外周血细胞单细胞悬液的制备 骨髓及外周血都是天然的单个细胞，可直接
标记，再溶血。
单细胞的分离制备
分离液 血液生理盐水
离心 ，
单个核细胞
单核细胞: 利用单核细胞在短时培养贴壁快
的特性（），可采用短时培 养获得较纯的单核细胞.
、培养细胞样品的制备(贴壁细胞) 培养板 吸去培养液 洗次 胰蛋白酶 ℃，室温， 含血清的培养基 吹打 洗次 单细胞悬液。
二、流式细胞术的特点、优点
速度快 极短时间内可分析大量细胞，每秒可检测上万
个 细胞，甚至几万个细胞。 多参数分析
可同时分析单个细胞的多种特性，获得单个细 胞多种信息，也可以根据其细胞表面标志的不同把 细胞群分为各亚群。
定性、定量分析细胞
通过荧光染色对单细胞的某些成分，如：、抗原或 受体等进行定性、定量分析。
抗与待测标本反应后，洗去未结合抗体再加 入荧光标记的二抗，形成有荧光的抗原抗 体抗体复合物。其操作复杂、费时，目前 很少用。在科研中需要一些新的抗体没有直 接抗体，只能采用此方法。
直接标记是在标记时加入连接着荧光素 的特异性抗体，该方法简单，目前广泛应用 于各实验室。
间标
羊抗兔
兔抗小鼠 小鼠
直标
根据细胞部位的不同，可分为细胞表面和细胞内抗 原染色，细胞内标记需要固定、破膜等步骤 .细胞表面抗原的标记法（外周血为例 ）
干扰。 . 易与被标记的物质结合，而不影响被标记
物的特异性。 . 稳定性好，不易受光、温度、标本抗凝剂
和固定剂等影响。
常用荧光探针组合
细胞表型分析： 双色分析：与 三色分析：双色分析 四色分析：三色分析
含量分析： 凋亡与坏死分析：
凋亡用 双染
四、标本的收集、单细胞悬液的 制备
骨髓、外周血、细胞株、组织 器官、 胸水、腹水、尿液脱落细胞等
目钢筛网过滤 目尼龙网过滤 离心 ， 洗次 单细胞悬液。
网搓法 组织块洗去血液 目钢筛网轻搓 生理盐水 收集滤液 目尼龙网过滤 离心 ，
洗次 单细胞悬液。 研磨法 组织块洗去血液 研磨器研至匀浆 目钢筛网
目尼龙网过滤 离心 ， 洗次 单细胞悬液。
. 石蜡包埋组织单细胞悬液的制备
手术获得的新鲜实体组织，常要送病理石蜡包 埋处理，这些标本也可用于流式细胞术的检测。
.了解激发光波长和发射波长
常用荧光素
异硫氰酸（） 藻红蛋白（） 碘化丙啶（） 藻红蛋白偶联物（）
激发光波长（ ）
发射波长()
（绿） （橙） （红） （红）
藻红蛋白偶联物（）
（红外）
别藻青蛋白（） 别藻青蛋白偶联物（）
（红） （红外）
. 要有高的光子产量提高信号强度。 . 对激光有强的吸收降低背景噪音。 . 激发光谱和发射光谱之间差距大减少
.阴性染色对照已知不表达某种抗原的细胞即为阴性 细胞群，如双染检测健康人血液淋巴细胞亚群时， 应有一群不表达这两种抗原的双阴性细胞群（主 要是细胞），可作阴性对照。
灵敏度高
荧光能检测到单个微粒上标有荧光分子少于<个 (如或)；前向角检测到小于颗粒。
分选感兴趣的细胞
纯度达，收获率可达。
流式细胞术的应用范围 细胞大小
细胞表面分子系列 细胞浆内分子：胞内细胞因子
细胞核内分子： 细胞功能检测:源自胞周期、细胞凋亡 其他：线粒体膜电位、细胞内钙离子浓度
三、单克隆抗体标记荧光探针选择
激光
前向散射 FALS Sensor
Freq
侧向散射，荧光信号
Fluorescence
的液流系统（如何形 成单个细胞流）
样本管
鞘液管
近年来流式细胞术在我国得到很快的 发展，应用范围不断增大。目前，流式细胞术 作为一门生物检测技术广泛应用于免疫学、血 液学、肿瘤学、细胞遗传学、细胞生物学、生 物化学等临床医学和基础医学研究领域。
全血（×）相应抗体→避光孵 育 → 溶血素→ 室温 → 洗次 →上机分析（ 多聚甲醛固定）。
. 细胞浆或核内抗原标记法 收集单细胞悬(×)固定剂 室温， 洗涤
去固定液 破膜剂及抗体 室温， 洗涤次 上机分析（ 多聚甲醛固定）。
. 细胞表面和细胞内抗原同时标记 在流式分析中通常需要细胞膜表面和细胞内同
醇乙脱水： ％→→％→ →醇乙→二甲 苯→石蜡包埋 脱蜡水化： 二甲苯脱蜡→ ％醇乙 →→→％→％→蒸馏水
石蜡包埋组织制备 单细胞悬液
石蜡包埋组织切片 二甲苯脱蜡 天
水化
乙醇，蒸馏水 组织器官 胰蛋白酶 ℃，
冰
目钢筛网过滤
目尼龙网过
滤 离心 ， 洗次 单细胞悬液
. 脱落细胞单细胞悬液的制备 包括： 尿液脱落细胞 胸水、腹水脱落细胞 冲洗液脱落细胞
. 组织器官单细胞悬液的制备
酶消化法
组织器官
机械法
单细胞制备仪 剪碎法
网搓法 研磨法
（）、酶消化法 组织块洗去血液 剪成小块 胰蛋白酶
℃， 含血清的培养基 目钢筛网过滤 目尼龙网过滤 离心 ， 洗次 单 细胞悬液。
（）、机械法 单细胞制备仪
组织块洗去血液 剪成小块 制备仪 目钢筛网过滤 目尼龙网过滤 离心 ， 洗次 单细胞悬液。 剪碎法 组织块洗去血液 剪至浆状 吸管轻轻吹打
流式细胞术实验方法及应用
科研型
Our weapon：EPICS ALTRA Flow Cytosorter
分选功能
激光
四色荧光
(、、、）
一、流式细胞术的原理
流式细胞仪的发展起源于细胞计数自动化的研究。 其原理是被荧光染色的单细胞或颗粒，经过高速的液 流系统形成细胞柱，排列成单细胞依次通过流动室， 在激光照射区域，携带荧光素细胞受激发产生不同的 荧光信号，这些荧光信号可以反映细胞的生物特性。