瞬时表达

对改变的基因分类
• 茉莉酸甲酯（MeJa）处理后的基因改变有 两种可能，一种是受MeJa诱导后基因表达 改变，但是不影响生物碱的合成，另外一 种就是基因改变引起了生物碱的积累。 • 为了基因分类，选取了两种蛋白启动子的 表达量作为标准，对预测基因进行实验研 究。 • PMT（腐胺-N-甲基转移酶）和PAL（L-苯丙 酸氨基水解酶）
何为cDNA-AFLP
• cDNA-AFLP技术结合了RT-PCR和AFLP技术， 其基本原理：以纯化的mRNA为模板，反转 录合成cDNA。用识别序列分别为6-bp和4bp的两种限制性内切酶酶切双链cDNA，酶 切片段与人工接头连接后，利用与接头序 列互补的引物进行预扩增和选择性扩增， 扩增产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳显示． • 常用的分析差异表达基因的方法 ，准确反 映基因间表达量的差别 。
三、研究需要
• 随着通过分析基因组规模数据集获得许 多新的 候选基因，例如微阵列转录模式或蛋白质-蛋白质 的互作研究，并且只有少量的能够用于转基因研 究。因此就需要有新的方法来迅速测定基因的功 能和鉴定新基因 。
• 瞬时表达分析不适合复杂的生物体研究，但是植 物原生质体瞬时表达分析在研究广泛的分子机制 ，包括信号传导和新陈代谢通道，以及转录的网 络调控是很有用的。
何为瞬时表达(Transient expression)
• 瞬时表达：外源基因进入受体细胞后，未整合进 受体细胞基因组而立即转录，出现基因产物 。
• 是一种快速的研究基因表达、蛋白质亚细胞定位 及基因间互作的一种重要手段，与传统的转基因 相比，瞬时表达不需要整合到染色体上，因此具 有简单、快速、周期短、准确等优点 。瞬时表达 不受基因的位置效应和基因沉默的影响，表达效 率较稳定，转化率高。同时，瞬时表达不产生可 遗传的子代，生物安全性高。
图示（R平方为相似度）
烟草茉莉酸信号途径研究
• 技术路线
一、茉莉酸处理结果分析
二、 发生改变的基因分类
三、确定基因研究参考指标 四、实验验证参考指标 五、筛选可能的诱导基因 六、过表达研究获得的基因
何为BY-2细胞
• • • • • • • • • • • 烟草BY2细胞(Nicotiana tabacum L．ev Bright Yellow 2。BY2)是一个非常重要且用途广泛的细胞系。它由Kato 等于1972分离得到．在现有已建立的成熟植物细胞系 中被认为是植物细胞中的Hela细胞。BY2细胞可以比较 容易的转化外源基因，且转基因细胞团和悬浮培养细 胞都较易得到。此外，该细胞系具有高度的同一性，并且 生长迅速，经阿非迪霉素(aphidicholin)处理后，可以获得 具有高度同周期性的细胞．1周内可以增加80～100倍。 因此．BY2细胞已经成为研究细胞周期的模式系统，这 使得该细胞系成为分子生物学和细胞生物学研究的良好 材料。
过表达转染BY-2细胞
• 将两个新发现的基因克隆进过表达载体， 后导入农杆菌，侵染受过MeJa诱导过转基 因BY-2细胞系。作为对照，只带有新霉素磷 酸转移酶标记基因的载体pDE1001和经过瞬 时表达分析验证过，不影响PMT活性的基因 T172 ORF的载体。结果显示， NtORC1 和 NtJAP1 的过表达会导致转基因组织的过早 褐化。
二、Then reaLeabharlann on for this problem
• 1、基因的种类繁多，通过试验来区分的难 度大。 • 2、被认为是“黄金标准”的稳定转基因技 术解决了部分基因的功能研究问题，但是 受到遗传扰动这一致命的影响。培养大批 量的转基因植株工作繁重。 • 3、通过正常的生物活动如插入突变沉默和 基因异位表达往往不能得到预期的表型。
自动化操作平台
自动化操作系统
载体质粒对比分析
• 在任何实验方案中，能够准确又简单的克 隆出所有必需的DNA片段是很重要的，目的 是为了对大型基因组进行系统的功能分析 • 本文设计将绿色荧光蛋白和萤火虫荧光素 酶 ，分别连接大的双向T-DNA质粒和最小的 骨架质粒，转入拟南芥和烟草BY-2原生质体 进行瞬时表达。结果表明最小质粒的表达 效率高。确定实验用的载体质粒为大肠杆 菌最小质粒
结果图
原因分析
• 1、活化的植物防御响应在转基因植物中的 适应性已经显示降低了。 • 2、这项观察可用生物碱（或其他次生代谢 分子）的积累来解释，生物碱的积累对多 数细胞类型是有毒性的，包括产生它们的 烟草细胞(Goossens et al., 2003a)。尽管 NtORC1和NtJAP1过表达不会导致强烈的生 长抑制，可是它会导致增强对胁迫的敏感 性通过大片胼胝体变成褐色来显示出来。
步做研究相似功能的基因协同性准备）
获得的基因
一次筛选及结果
• 每组做四个重复，实验均有一个内参。即是 PMTpro::fLUC::35Ster+一个基因（ 35Spro::GCS::35Ster）+35Spro::rLUC::35Ster • 或者PALpro::fLUC::35Ster+一个基因（ 35Spro::GCS::35Ster）+35Spro::rLUC::35Ster。 • 共转染。用GUS作对照。第一天是转染，第二天 进行细胞溶解和荧光素酶分析。 • 最终发现NtORC1 和NtJAP1 和MC307导致PMT启动 子的活性增加，但是不影响PAL启动子活性。
• 4、利用自动化的TEAs ,成功的破解了烟草尼 古丁生物合成的激活通道，发现了两个转 录调控因子， NtORC1 和NtJAP1 。序列分析 表明两者都属于AP-2家族 ，含有ORCA转录 因子来调节长春花中萜类吲哚生物碱的合 成。
个人心得
• 通过本文献的学习，基本了解了瞬时表达 应用于基因功能筛选的原理及思路设计流 程。 • 懂得了一个良好的实验需要缜密的实验设 计和充分的实验验证。
Why chose these two proteins as the standard?
• PMT 在尼古丁生物合成的第一步，是一个 关键的催化作用酶。他的含量决定的尼古 丁合成的强度。
• PAL是酚类复合物合成的核心酶，他的含量 决定尼古丁的含量。
初步验证两个参考标准
• 分别克隆PMT 和PAL的上游和ORF，在他们的下 游连接上报告基因fLUC，构建表达载体 GCS::fLUC::35Ster。验证原生质体是否像细胞一 样受MeJa诱导。 • 分别将两种两种载体转化烟草BY-2原生质体做 瞬时表达分析，八个重复的平均 MeJa诱导前后 的结果如下：
结果图
二次筛选
• 通过超过十次的二次转染，统计数据与GUS 比较，分析结果表明， NtORC1 和NtJAP1 分 别是对照的2.9-10.3倍和1.4-2.9倍。而 MC307则未被证实。如下图（P值为差异值 ）
协同效应研究
• 通过共转染，研究了新发现的两个转录调 控因子NtORC1 和NtJAP1 的协同效应。结果 如下图
尼古丁生物合成调控功能因子的筛 选
• 1、查阅文献，了解相关研究后，通过代谢 物分析和cDNA-AFLP技术，研究茉莉酸甲酯 处理烟草BY-2细胞后基因的变化情况。 • 结果是：茉莉酸甲酯处理几个小时，细胞 新陈代谢系统完全改变，许多生物碱 ，尼 古丁，新烟碱，新烟草碱迅速积累，许多 基因的表达模式改变，多数为上调。
酶活测定结果
分析
• 上图显示，尽管fLUC和rLUC的酶活数目不同 ，但是有相同的趋势，他们的关联系数R =0.932。HEAT map 显示相同的样品之间 fLUC酶活性就存在很大的差异。他们之间的 平均标准误为6.9%，但是根据统计学关联 差异度，如果以rLUC的酶活数目为内部调控 做标准化，这种标准误就降低到了2.6%。 • 这就说明，在瞬时表达分析时，加入内部 调控报告基因，能够大大降低误差。
烟草细胞中茉莉酸信号通路自 动化和标准化的瞬时表达分析 探究
汇报人：***
综述
一、基因研究现状
尽管基因序列信息和基因组分析已近 大大提升了人们的研究空间，但是对 大多说基因的具体功能仍不是很清楚。 即使是在模式作物中，至少有三分之 一的基因功能是未知的。大多数基因 是依靠序列同源性和转录物类型进行 分类的，并且最多有十分之一的基因 是通过分子生物学和遗传学进行更深 的研究。基因功能研究受到挑战。
转化效率研究
• 分别以拟南芥PSB-L细胞原生质体和烟草BY2细胞原生质体为转录体，用10 μg带有 35Spro::eGFP::35Ster最小载体DNA做瞬时表 达分析，20h后，荧光蛋白量达到30%。如 果想提高含量，需要长时间的孵育。fLUC需 要超过一天。
质粒DNA的用量标准验证
• 因为质粒DNA的总量是瞬时表达实验的一个 限制因子。设计了带有35Spro::rLUC::35Ster 的最小质粒，转染拟南芥和烟草BY-2.来测 定0.5–10 μg之间，rLUC的活性。BY-2显示的 是一个对数关系曲线(R2=0.9943; n=8)，拟南 芥显示的是一个指数关系(R2 =0.9941; n =4) 。根据瞬时表达的要求原生质体数目为104 到105 原生质体数，选择了BY-2的使用量为 1μg。
类别 PMT（1-2h） PAL (2-4h) 未处理 36×10-3 156×10-3
MeJa诱导（50μM）
61×10-3 239×10-3
1.7倍 1.5倍
选择可能的诱导基因
• 通过cDNA-AFLP 标记研究6h MeJa诱导后编码
蛋白但功能未知的基因，挑选已经有预测的可能 参与转录过程的基因。共得到17条。如下图 RF。全部替代克隆进同一种 载体p2GW7（值得注意，这样做是为了进一
请老师，同学指点
谢谢
本文要点
• • • • • • 实验用的载体选择方法 原生质体PEG自动化转染 双荧光素酶转录读出标准化分析 原生质体转化效率分析 尼古丁生物合成途径中潜在调控因子筛选 NtORC1 和NtJAP1 转入BY-2 影响分析
设计自动化瞬时表达系统
• 根据已发表的瞬时表达步骤 (/sheenweb)，设计 了自动化的瞬时表达操作系统。该系统在TECAN Genesis 200机械化平台上进行 操作。（为本文章 所独创的）。该系统的好处如下： • 1、降低了实验规模和容器的需求量。 • 2、与传统的原生质体富集相比，该系统采用简单 的微滴定沉淀法。 • 3、自动化移液，精确简单。 • 4、周期短，小于2天，严格的无菌环境。
比对结果
双荧光素酶转录读出分析标准化
• 瞬时表达分析最终结果受到很多内在因素 的影响，比如原生质体的异质性，移液误 差和DNA的含量等。为了对瞬时表达分析进 行标准化，参考了生物统计原理，本文通 过萤火虫荧光素酶（fLUC）和海肾荧光素酶 （rLUC），分别连接上35S CaMV promoter ，形成35Spro::fLUC::35Ster 和 35Spro::rLUC::35Ster，做共瞬时瞬时表达分 析，共测定了八组48个样品在42分钟内的 酶活性变化。
如何构建载体
• 1、利用PCR技术扩增目的基因 • 2、利用Gateway技术创建入门克隆载体 • 3、进一步构建表达载体
Gateway™技术
总结与讨论
• 1、基因组学研究方法在某种程度上依赖于克隆序 列技能的有效性。并且，开发这些技能的障碍在 于创造上千的转基因个体非常困难，实验设计了 自动化的瞬时表达分析过程，提高了实验的精确 性和效率。对研究信号或生化途径中的特异片段 是至关重要的 。 • 2、利用Gateway技术创建入门克隆载体，这种载 体为相关的实验研究提供了足够的质粒。并且验 证了载体的大小和使用量。 • 3、通过设置内部调控基因，对TEAs进行了标准化 分析，进一步提高了实验的准确性。