食品分析课件6.蛋白质及氨基酸的测定
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采用红外幅射加热，样品受热均匀。 加热升温速度快，只需10分钟即可升温到
650℃。 保证最佳的沸腾条件不会产生沸腾滞后。 密闭性好，操作时无硫酸废气逸出。 采用300ml消化管，容积较大，可防止样品飞
溅损失。 消化时间20-60分钟。
复习：食品中蛋白质的测定方法
1.原理 2.试剂 3.仪器 4.测定步骤 5.计算
20种 α-氨基酸
R
蛋白质是由许多不同的α-氨基酸按一定 的序列缩合而成的大分子。
1.测定原理
样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化， 使蛋白质分解，分解产生的氨与硫酸结 合成硫酸铵，然后碱化蒸馏使氨游离， 用硼酸吸收后再用标准酸滴定，根据酸 的消耗量，可计算出蛋白质的含量。
粗蛋白？
2.试剂
① 浓硫酸 ② 硫酸铜 ③ 硫酸钾 ④ 40％氢氧化钠溶液 ⑤ 2％硼酸溶液 ⑥ 0.05mol/L盐酸（硫酸）标准溶液 ⑦ 混合指示剂
3.水扬酸比色法
样品中的蛋白质经H2SO4消化转化为铵盐溶 液后，在一定的酸度和温度下与水扬酸钠 和次氯酸钠作用生成有颜色的化合物，可 以在波长660nm处比色测定，求出样品含 氮量，计算蛋白质含量。
四、氨基酸总量的测定
（一）双指示剂甲醛滴定法 （二）电位滴定法 （三）茚三酮比色法
（一）双指示剂甲醛滴定法
3.操作方法
取含氨基酸20mg的样液2份，加水50ml 一份加中性红乙醇3滴，滴定成淡黄色 （PH8.2），耗碱v1 一份加百里酚酞3滴和中性甲醛20ml，滴 定成淡兰色（PH9.2），耗碱Fra Baidu bibliotek2
（一）双指示剂甲醛滴定法
4.计算
氨基酸态氮（g/100ml） =（N×（V2-V1）×0.014×100）/V
全自动凯氏定氮法
** 自动加碱 蒸馏，自动吸收 和滴定，自动数 字显示装置。可 计算总氮百分含 量并记录，12分 钟完成1个样。
全自动凯氏定氮仪
自动凯氏定氮法
消化装置用优质玻 璃制成的凯氏消化 瓶，红外线加热的 消化炉。一次可同 时消化8个样品， 30分钟可消化完毕。
配套的消化装置
配套的消化装置
（一）双指示剂甲醛滴定法
5.说明
测定食品中游离氨基酸总量 适合无色或浅色样品
（二）电位滴定法
1.仪器： 酸度计 磁力搅拌器 微量滴定管 2.试剂： 中性甲醛 0.05mol/L氢氧化钠
5份0.1％溴甲酚绿与1份0.1％甲基红混合
3.仪器
凯氏烧瓶 消化装置
凯氏定氮蒸镏装置
4.测定步骤
消化 蒸镏 滴定
1 2
4.测定步骤
①消化 精确称取样品移 入干燥的凯氏烧瓶中，加 入硫酸铜0.2g，硫酸钾3g 和浓硫酸20m1，消化后定 容100ml。
4.测定步骤
②蒸镏 连接好蒸馏装置， 接收瓶内加10ml硼酸及混 合指示剂2-3滴，吸取消 化液10.0ml,从漏斗倒入 浓碱至过量，加热蒸馏至 氨全部蒸出。
第六章 蛋白质及氨基酸的测定
一、蛋白质测定的意义 二、蛋白质的组成 三、蛋白质的测定方法 四、氨基酸总量的测定 五、挥发性盐基氮测定
一、蛋白质测定的意义
1.蛋白质是重要的营养物质 2.为合理开发利用食品资源、优化膳食
配方提供依据
二、蛋白质的组成
构成单体 ----氨基酸
结构通式：
O
H2N CH C OH
优点？
三种凯氏定氮法的比较
称样量 蒸镏方法 试剂用量
常量 ﹥2g 直接 多
微量 ﹤0.1g 水蒸汽 少
半微量
0.1—2g 水蒸汽 少
介绍:全自动凯氏定氮法
采用经典的凯氏定氮法仍是食品分 析、中最广泛应用而较精确的方法，但 操作也比较费时费力，近来已有特用的 蛋白质分析仪----全自动凯氏定氮仪它 不仅省时省力，而且数据准确可靠。
（三）蛋白质的其他测定方法
1.双缩脲法 2.紫外线吸收法 3.水扬酸比色法
1.双缩脲法
①原理: 双缩脲与碱及少量硫酸铜溶液生成紫红
色的络合物，此反应称为双缩脲反应。 蛋白质分子中含有肽键(一CO—NH一)， 与双缩脲结构相似，因此也能呈现此反 应，其颜色深浅与蛋白质含量成正比。
1.双缩脲法
② 试剂和仪器 碱性硫酸铜溶液 四氯化碳 分光光度计，最大吸收波长为560nm。 离心机，4000转／分钟
1.双缩脲法
③ 操作步骤 A.标准曲线的绘制
b.样品的测定 准确称取标准蛋白质样和食品样品,加
lml四氯化碳,用碱性硫酸铜溶液准确稀 释至50ml，振摇、静置、离心、比色。
1.双缩脲法
1.原理
氨基酸不能直接用酸碱来滴定,但是 氨基酸分子中的氨基能与甲醛结合，使 氨基上的质子游离出来，可用碱标准溶 液滴定测定氨基酸的含量。
（一）双指示剂甲醛滴定法
2.试剂
中性甲醛 0.05mol/L氢氧化钠标准溶液 0.1％中性红乙醇溶液 0.1%百里酚酞乙醇溶液
（一）双指示剂甲醛滴定法
4.测定步骤
③滴定 用0.05mol/L盐酸标准溶液滴定 上述吸收液,至溶液由蓝色变为微红色 即为终点，记录盐酸的用量V1
同时做空白实验，消耗盐酸标准溶液的 体积V2
食品中蛋白质的测定方法
5. 计算
样品消耗盐酸标准溶液的体积V1(ml) 空白实验，消耗盐酸标准溶液的体积V2(ml) 盐酸标准溶液的浓度C(mol/L) 样品的质量m(g) 1ml盐酸标准溶液相当于氮质量(g),为0.014 氮换算为蛋白质的系数F
④ 注意事项 a 当肽链中含有脯氨酸时，有多量糖类共
存则显色不好 b 组氨酸以外其他游离的氨基酸、二肽等
不显色,但少数非蛋白质均显色. 双缩脲法灵敏度较差，但操作简单，快速
2.紫外线吸收法
蛋白质中存在含共轭双键的芳香环基 (酪 氨酸和色氨酸) ，在紫外区内280nm波长具 有吸收高峰， 蛋白质溶液的吸光值与浓度 成正比。因此，通过测定蛋白质溶液的吸 光度，并参照事先用凯氏定氮法分析的标 准样品，可得出蛋白质的含量。
食品中蛋白质的测定方法
6.注解
消化 蒸镏 滴定
（二）常量和微量凯氏定氮法
1.依据原理 2.操作方法 3.试剂和仪器
常量凯氏定氮法
①样品用量多 ②试剂用量多 ③直接蒸镏
常量凯氏定氮蒸馏装置图
微量凯氏定氮法
①样品用量少 ②试剂用量少 ③水蒸汽蒸镏
半微量凯氏定氮法
①样品用量少 ②试剂用量少 ③水蒸汽蒸镏
650℃。 保证最佳的沸腾条件不会产生沸腾滞后。 密闭性好，操作时无硫酸废气逸出。 采用300ml消化管，容积较大，可防止样品飞
溅损失。 消化时间20-60分钟。
复习：食品中蛋白质的测定方法
1.原理 2.试剂 3.仪器 4.测定步骤 5.计算
20种 α-氨基酸
R
蛋白质是由许多不同的α-氨基酸按一定 的序列缩合而成的大分子。
1.测定原理
样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化， 使蛋白质分解，分解产生的氨与硫酸结 合成硫酸铵，然后碱化蒸馏使氨游离， 用硼酸吸收后再用标准酸滴定，根据酸 的消耗量，可计算出蛋白质的含量。
粗蛋白？
2.试剂
① 浓硫酸 ② 硫酸铜 ③ 硫酸钾 ④ 40％氢氧化钠溶液 ⑤ 2％硼酸溶液 ⑥ 0.05mol/L盐酸（硫酸）标准溶液 ⑦ 混合指示剂
3.水扬酸比色法
样品中的蛋白质经H2SO4消化转化为铵盐溶 液后，在一定的酸度和温度下与水扬酸钠 和次氯酸钠作用生成有颜色的化合物，可 以在波长660nm处比色测定，求出样品含 氮量，计算蛋白质含量。
四、氨基酸总量的测定
（一）双指示剂甲醛滴定法 （二）电位滴定法 （三）茚三酮比色法
（一）双指示剂甲醛滴定法
3.操作方法
取含氨基酸20mg的样液2份，加水50ml 一份加中性红乙醇3滴，滴定成淡黄色 （PH8.2），耗碱v1 一份加百里酚酞3滴和中性甲醛20ml，滴 定成淡兰色（PH9.2），耗碱Fra Baidu bibliotek2
（一）双指示剂甲醛滴定法
4.计算
氨基酸态氮（g/100ml） =（N×（V2-V1）×0.014×100）/V
全自动凯氏定氮法
** 自动加碱 蒸馏，自动吸收 和滴定，自动数 字显示装置。可 计算总氮百分含 量并记录，12分 钟完成1个样。
全自动凯氏定氮仪
自动凯氏定氮法
消化装置用优质玻 璃制成的凯氏消化 瓶，红外线加热的 消化炉。一次可同 时消化8个样品， 30分钟可消化完毕。
配套的消化装置
配套的消化装置
（一）双指示剂甲醛滴定法
5.说明
测定食品中游离氨基酸总量 适合无色或浅色样品
（二）电位滴定法
1.仪器： 酸度计 磁力搅拌器 微量滴定管 2.试剂： 中性甲醛 0.05mol/L氢氧化钠
5份0.1％溴甲酚绿与1份0.1％甲基红混合
3.仪器
凯氏烧瓶 消化装置
凯氏定氮蒸镏装置
4.测定步骤
消化 蒸镏 滴定
1 2
4.测定步骤
①消化 精确称取样品移 入干燥的凯氏烧瓶中，加 入硫酸铜0.2g，硫酸钾3g 和浓硫酸20m1，消化后定 容100ml。
4.测定步骤
②蒸镏 连接好蒸馏装置， 接收瓶内加10ml硼酸及混 合指示剂2-3滴，吸取消 化液10.0ml,从漏斗倒入 浓碱至过量，加热蒸馏至 氨全部蒸出。
第六章 蛋白质及氨基酸的测定
一、蛋白质测定的意义 二、蛋白质的组成 三、蛋白质的测定方法 四、氨基酸总量的测定 五、挥发性盐基氮测定
一、蛋白质测定的意义
1.蛋白质是重要的营养物质 2.为合理开发利用食品资源、优化膳食
配方提供依据
二、蛋白质的组成
构成单体 ----氨基酸
结构通式：
O
H2N CH C OH
优点？
三种凯氏定氮法的比较
称样量 蒸镏方法 试剂用量
常量 ﹥2g 直接 多
微量 ﹤0.1g 水蒸汽 少
半微量
0.1—2g 水蒸汽 少
介绍:全自动凯氏定氮法
采用经典的凯氏定氮法仍是食品分 析、中最广泛应用而较精确的方法，但 操作也比较费时费力，近来已有特用的 蛋白质分析仪----全自动凯氏定氮仪它 不仅省时省力，而且数据准确可靠。
（三）蛋白质的其他测定方法
1.双缩脲法 2.紫外线吸收法 3.水扬酸比色法
1.双缩脲法
①原理: 双缩脲与碱及少量硫酸铜溶液生成紫红
色的络合物，此反应称为双缩脲反应。 蛋白质分子中含有肽键(一CO—NH一)， 与双缩脲结构相似，因此也能呈现此反 应，其颜色深浅与蛋白质含量成正比。
1.双缩脲法
② 试剂和仪器 碱性硫酸铜溶液 四氯化碳 分光光度计，最大吸收波长为560nm。 离心机，4000转／分钟
1.双缩脲法
③ 操作步骤 A.标准曲线的绘制
b.样品的测定 准确称取标准蛋白质样和食品样品,加
lml四氯化碳,用碱性硫酸铜溶液准确稀 释至50ml，振摇、静置、离心、比色。
1.双缩脲法
1.原理
氨基酸不能直接用酸碱来滴定,但是 氨基酸分子中的氨基能与甲醛结合，使 氨基上的质子游离出来，可用碱标准溶 液滴定测定氨基酸的含量。
（一）双指示剂甲醛滴定法
2.试剂
中性甲醛 0.05mol/L氢氧化钠标准溶液 0.1％中性红乙醇溶液 0.1%百里酚酞乙醇溶液
（一）双指示剂甲醛滴定法
4.测定步骤
③滴定 用0.05mol/L盐酸标准溶液滴定 上述吸收液,至溶液由蓝色变为微红色 即为终点，记录盐酸的用量V1
同时做空白实验，消耗盐酸标准溶液的 体积V2
食品中蛋白质的测定方法
5. 计算
样品消耗盐酸标准溶液的体积V1(ml) 空白实验，消耗盐酸标准溶液的体积V2(ml) 盐酸标准溶液的浓度C(mol/L) 样品的质量m(g) 1ml盐酸标准溶液相当于氮质量(g),为0.014 氮换算为蛋白质的系数F
④ 注意事项 a 当肽链中含有脯氨酸时，有多量糖类共
存则显色不好 b 组氨酸以外其他游离的氨基酸、二肽等
不显色,但少数非蛋白质均显色. 双缩脲法灵敏度较差，但操作简单，快速
2.紫外线吸收法
蛋白质中存在含共轭双键的芳香环基 (酪 氨酸和色氨酸) ，在紫外区内280nm波长具 有吸收高峰， 蛋白质溶液的吸光值与浓度 成正比。因此，通过测定蛋白质溶液的吸 光度，并参照事先用凯氏定氮法分析的标 准样品，可得出蛋白质的含量。
食品中蛋白质的测定方法
6.注解
消化 蒸镏 滴定
（二）常量和微量凯氏定氮法
1.依据原理 2.操作方法 3.试剂和仪器
常量凯氏定氮法
①样品用量多 ②试剂用量多 ③直接蒸镏
常量凯氏定氮蒸馏装置图
微量凯氏定氮法
①样品用量少 ②试剂用量少 ③水蒸汽蒸镏
半微量凯氏定氮法
①样品用量少 ②试剂用量少 ③水蒸汽蒸镏