多花木蓝盐胁迫的生理响应试验方案模板

多花木蓝盐胁迫的生理响应试验方案

材料和样品: 多花木兰种子、NaCl、完全培养液( 硝酸钙1克、磷酸二氢钾0.25克、硫酸镁0.25克、氯化铁0.25克、氯化钾或硝酸钾0.25克) 、蒸馏水。

溶液培养皿设置: 设置5组不同培养条件, 选择饱满、均匀、外观良好的种子, 放入溶液培养皿中, 每皿30粒, 分别加入相同量的完全培养液及6ml不同浓度的NaCl溶液( 浓度梯度: 0g/L、2 g/L、4 g/L、8 g/L、12 g/L) , 编号1、2、3、4、5, 第1组为对照组, 实验中每组设3个重复试验。

将培养皿置于温室中培养, 每天下午3时适当补充蒸发水分, 以维持盐分浓度的稳定。培养相同时长, 待多花木蓝长出幼苗后, 分别测定5组多花木蓝幼苗的各项指标。

一、多花木蓝幼苗生长特性指标测定

生长指标测定: 记录每组植株成活数量, 计算成活率; 用直尺和游标卡尺测量株高、茎粗、最大侧根长。

根系活力的测定: TTC法

材料、设备仪器及试剂

( 一) 材料: 水培的多花木蓝根系。

( 二) 仪器设备: 分光光度计; 分析天平( 感量0.1mg) ; 电子顶载天平( 感量0.1g) ; 温箱; 研钵; 三角瓶50ml; 漏斗; 量筒100ml; 吸量管10ml; 刻度试管10ml; 试管架; 容量瓶10ml; 药勺; 石英砂适量; 烧杯10ml、1000ml。

( 三) 试剂: 1) 乙酸乙酯( 分析纯) ; 2) 次硫酸钠( Na2S2O4) , 分析纯, 粉末; 3) 1%TTC溶液: 准确称取TTC1.0g, 溶于少量水中, 定容到100ml, 用时稀释至各需要的浓度; 4) 磷酸缓冲液( 1/15mol·L-1, pH7) 。5) 1mol·L-1硫酸: 用量筒取比重1.84的浓硫酸55ml, 边搅拌边加入盛有500ml蒸馏水的烧杯中, 冷却后稀释至1000ml; 6) 0.4mol·L-1琥珀酸: 称取琥珀酸4.72g, 溶于水中, 定容至100ml 即成。

三、实验步骤

( 1) TTC标准曲线的制作: 取0.4%TTC溶液0.2ml放入10ml量瓶中, 加少许Na2S2O4粉摇匀后立即产生红色的甲腙。再用乙酸乙酯定容至刻度, 摇匀。然后分别取此液0.25ml、0.50ml、 1.00ml、1.50ml、2.00ml置10ml容量瓶中, 用乙酸乙酯定容至刻度, 即得到含甲腙25μg、50μg、100μg、150μg、200μg的标准比色系列, 以空白作参比, 在485nm波长下测定吸光度, 绘制标准曲线。( 2) 称取5组根尖样品各0.5g, 每组取三次, 分别编号11、12、13, 21、22、23, 31、32、33, 41、42、43, 51、52、53, 放入10ml 烧杯中, 加入0.4%TTC溶液和磷酸缓冲液的等量混合液10ml, 把根充分浸没在溶液内, 在37℃下暗保温1～3h, 此后加入1mol·L-1硫酸2ml, 以停止反应。( 与此同时做5个空白实验, 先加硫酸, 再加根样品, 其它操作同上) 。

( 3) 把根取出, 吸干水分后与乙酸乙酯3～4ml和少量石英砂一起在研钵内磨碎, 以提出甲腙。红色提取液移入试管, 并用少量乙酸

乙酯把残渣洗涤二、三次, 皆移入试管, 最后加乙酸乙酯使总量为10ml, 用分光光度计在波长485nm下比色, 以空白试验作参比测出吸光度, 查标准曲线, 即可求出四氮唑还原量。

四、结果计算

四氮唑还原强度( mg.g-1根鲜重h-1) ＝四氮唑还原量( mg) /根重( g) ×时间( h)

叶绿素含量测定: 分光光度法

材料、仪器设备及试剂

( 一) 材料: 新鲜的多花木蓝叶片。

( 二) 仪器设备: 1. 分光光度计; 2. 电子顶载天平( 感量0.01g) ; 3. 研钵; 4. 棕色容量瓶; 5. 小漏斗; 6. 定量滤纸; 7. 吸水纸; 8. 擦境纸;

9. 滴管。

( 三) 试剂: 96％乙醇( 或80％丙酮) ; 石英砂; 碳酸钙粉。

三、实验步骤

1. 取新鲜多花木蓝叶片, 擦净组织表面污物, 剪碎( 去掉中脉) , 混匀。

2. 称取5组剪碎的新鲜样品各0.2g, 分别放入研钵中, 加少量石英砂和碳酸钙粉及2～3ml95％乙醇, 研成均浆, 再加乙醇10ml, 继续研磨至组织变白。静置3～5min。

3. 取滤纸1张, 置漏斗中, 用乙醇湿润, 沿玻棒把提取液倒入漏斗中, 过滤到25ml棕色容量瓶中, 用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次, 最后连同残渣一起倒入漏斗中。

4. 用滴管吸取乙醇, 将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至25ml, 摇匀。

5. 把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内。以95％乙醇为空白, 在波长665nm、649nm下测定吸光度。

四、实验结果计算: 将测定得到的吸光值代入下面的式子:

Ca=13.95A665－6.88A649

Cb=24.96A649－7.32A665

据此即可得到叶绿素a和叶绿素b的浓度( Ca、Cb: mg/L) , 二者之和为总叶绿素的浓度。最后根据下式可进一步求出植物组织中叶绿素的含量:

叶绿素的含量( mg/g) = [叶绿素的浓度×提取液体积×稀释倍数]/样品鲜重( 或干重) 。

二、多花木蓝幼苗生理指标测定

超氧化物歧化酶SOD测定: 氮蓝四唑(NBT)比色法

材料、仪器设备及试剂

( 一) 材料: 多花木蓝幼苗的叶片

( 二) 仪器设备: 1.高速台式离心机; 2.分光光度计; 3.微量进样器; 4.荧光灯( 反应试管处照度为4000Lx) ; 5.试管或指形管数支。

( 三) 试剂 1. 0.05mol/L 磷酸缓冲液( pH7.8) ; 2. 130mmol/L 甲硫氨酸( Met) 溶液: 称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml; 3.750μmol/L 氮蓝四唑溶液: 称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml, 避光保存; 4. 100μmol/L EDTA－Na2溶液: 称取