甲胎蛋白异质体

甲胎蛋白异质体

甲胎蛋白异质体（Variants of AFP or molecular heterogenetic of AFP ）是一种单链糖蛋白，含糖量约为4％左右。不同组织细胞合成的AFP，其糖链结构有所不同，对植物凝集素的结合能力也不相同，此种糖链结构不同的AFP称为AFP的亚型或变异体，也称为AFP分子异质体。近年来对AFP异质进行了电泳、糖链结构及与植物凝集素结合能力等方面进行了深入研究。有资料表明，AFP异质体存在着分子大小和电荷量的差异。淀粉胶电泳将人肝癌血清AFP分为4种亚型；用SDS聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳发现AFP可分为分子量72kD 和kD两种成分；等电聚焦结合交叉免疫电泳可使胎儿AFP分成10种等电点不同的异质体。这表明AFP异质体存在着电泳不无一性，这与其一级结构差异有关。其C－末端结构基本相同，N末端至少有3种不同结构，这能否产生AFP电泳异质性有待于证实。AFP结构中的糖链主要由甘露糖、半乳糖、N－乙酰葡萄糖和唾液酸，并以寡糖单位的形式组成。AFP异质体糖链结构的差异主要表现在分支结构的不同，刀豆素A（ConA）结合型和非结合型AFP异质体的糖链结构模型差异表现在一个分支中有无－GLcNAc-Gal-NeuNAc结构。对人肝癌AFP 糖链结构电泳研究发现，其寡糖分为中性（N）、酸性（A1，A2）三种成分。进一步研究证实N两分支末端均由半乳糖组成，A1两分支末端分别为半乳糖和N－乙酰神经氨酸，A2则均为N －乙酰神经氨酸。卵黄囊肿瘤的AFP其ConA亲和性组占50％左右，肝癌腹水中与LCA结合的AFP糖链中具有与Asn连接的N－乙酰基葡萄糖胺残基，而在非结合型异质体的糖链中无此成分。

根据AFP与外源性凝集素（Lectin）结合能力的差异，可分为不同的变异体。采用扁豆凝集素（LCA）／刀豆素A亲和电泳或层析技术能将AFP分为LCA／ConA非结合型AFP（AFP －N－L／AFP－N－C）和LCA／ConA结合型AFP（AFP－R－L／AFP－R－C）两种。新的Lectin 的应用，使AFP在糖链结构上异质体达9种之多。AFP异质体的命名方法为：从阴极开始在LCA亲和电泳上AFP的条带依次为L1、L2、L3；在E－PHA亲和电泳上AFP的条带依次为P1、P2、P3、P4、P5；用ConA时按AFPC1、C2命名；alloA时按AFPA1、A2、A3命名。AFPL2、L3完全不能分离，存在中间成分时按AFPL2、L3命名，AFPP4、P5分离不充分时命名为AFP－P4＋AFP －P5。因此，AFP对不同的Lectin反应所表现的异质体不同，故可用于疾病的鉴别诊断。

AFP异质体亲和交叉免疫电泳检测法

【原理】

根据AFP对刀豆素（ConA）或小扁豆凝集素（LCA）结合能力的不同，可区别原发性肝细胞癌与非原发性肝癌引起的AFP升高，提高AFP对肝癌的诊断价值。此法原理是将检样于含LCA的琼脂糖凝胶中电泳，与LCA结合型AFP在电泳时被阻留，而非结合型AFP则向阳极侧泳动。然后，与首次电泳的方向垂直，在含抗AFP的琼脂糖胶中作第二次电泳。此时被首次电泳分离的AFP异质体，将分别于含抗AFP的凝胶板中形成沉淀峰,根据峰的大小即可了解结合型或非结合型AFP所占的比例。

【试剂】

1．小扁豆凝集素（LCA）。

2．抗AFP血清：同ELISA法。

3．L琼脂糖：琼脂糖加L 巴比妥缓冲液100ml，沸水浴中使溶，加入NaN3使达L，按需要量分装后密塞，4℃保存。

4．125I－AFP。

【试剂】

1．小扁豆凝集素（LCA）。

2．抗AFP血清：同ELISA法。

3．L琼脂糖：琼脂糖加L pH 巴比妥缓冲液100ml，沸水浴中使溶，加入NaN3使达L，按需要量分装后密塞，4℃保存。

4．125I－AFP。

【操作】

1．将L琼脂糖融化后，在6cm×12cm洁净玻板之一侧浇注2cm×12cm（厚）凝胶条（约需凝胶液），凝固后于距内缘2～3mm处切割一×10cm的槽。

2．用巴比妥缓冲液将LCA稀释成2mg/ml（－20℃可保存1个月），取80μl加入冷至56℃的已融化琼脂糖凝胶1ml中，混匀后浇注于上述槽中。待凝固后，于此胶条上距阴极端处打一直径～的孔，距此孔处打第二个孔（第二份检样）。

3．两孔内各加一份待测血清，加样量5～10μl。以L溴酚蓝为指示剂，10V／cm稳压电泳，至白蛋白泳出4cm时关闭电源。

4．将抗AFP血清按效价与融化并冷至56℃的琼脂糖胶液混合（琼脂糖最终浓度为L，抗AFP达最适浓度），并浇注玻板的其余部分（4cm×12cm），约需含抗血清胶液，使凝固。

5．于LCA胶条下处空白凝胶内切割一×10cm的细槽，槽内注入混有L溴酚蓝5μl的125I－AFP 20μl（约6万～7万cpm）。如混入融化的L琼脂糖胶液中浇注更好。10V／cm 稳压电泳，电泳方向与第一次电泳垂直。至白蛋白泳出4cm时终止。

6．电泳结束后，用滤纸覆盖于凝胶板表面，置37℃干燥后，于暗室覆盖X光底片，室温曝光48h，显影，定影后观察。

【结果判断】

将X光胶片置坐标纸上，以峰两侧水平线作基线，峰形下总面积（小格数）为100％，各所占面积（小格数）与总面积的百分比即AFP异质体的百分比。

AFP异质体亲和电泳免疫印迹法

【原理】

将含AFP的待检血清置于含LCA的琼脂糖凝胶中电泳。LCA结合型AFP泳动速度慢，而CA非结合型AFP泳动速度快，形成前后2条区带。用吸附有抗人AFP抗体的硝酸纤维素（NC）膜进行免疫印迹，再依次与酶标记抗人AFP抗体和酶底物反应则显色。NC膜上可呈现2条着色区带，透明后用光密度计扫描，得出结合型与非结合型AFP所占百分比。

【试剂】

1．小扁豆凝集素（LCA）。

2．马抗人AFP抗体。

3．兔抗人AFP－HRP。

4．结合马抗人AFP抗体的硝酸纤维素膜（简称马抗人AFP－NC膜）；将NC膜剪裁成与凝胶板相同大小，浸于最适稀释浓度的马抗人AFP抗体溶液中，5min后取出，电吹风吹干，4℃保存，4周内稳定。

5．洗涤液：150mmol/L NaCl溶液，含% Tween-20。