异养小球藻对铁_锌和钙的生物富集作用研究

异养小球藻对铁、锌和钙的生物富集作用研究
陈俊辉，魏东
（华南理工大学轻工与食品学院，广东广州 510640）
摘要：本文研究了异养培养条件下，小球藻对微量元素铁、锌、钙的生物富集作用。

研究表明，异养小球藻对于三种这微量元素有着不同的富集能力，当铁、锌、钙三种金属离子的浓度分别保持在0.36 mmol/L、0.60 mmol/L和1.50 mmol/L时，小球藻生物量分别达到2.85 g/L、3.025 g/L和3.425 g/L，同时小球藻胞内铁、锌、钙含量分别为0.688 mg/g、0.131 mg/g和0.125 mg/g，与使用对照培养基的结果相比有显著增加。

在500 L发酵罐中进行补料分批培养，异养小球藻最高细胞密度可达到57.000 g/L，胞内铁、锌、钙的含量也分别增加到0.128 mg/g、0.051 mg/g和0.585 mg/g。

本研究结果对于开发具有多重保健功能的小球藻食品具有重要意义。

关键词：异养；小球藻；生物富集；金属元素；补料分批培养
文章篇号：1673-9078(2010)11-1192-1196
Bioenrichment of Fe, Zn and Ca by Heterotrophic Chlorella
CHEN Jun-hui, WEI Dong
(College of Light Industry and Food Sciences, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China) Abstract: The bioenrichment of Fe, Zn and Ca by Chlorella in heterotrophic culture was investigated. It was found from our research results that the bioenrichment abilities of of Fe, Zn and Ca by Chlorella were different. When the concentrations of Fe, Zn and Ca in the medium were kept at 0.36 mmol/L, 0.60 mmol/L and 1.500 mmol/L, respectively, the biomass of Chlorella was 2.85 g/L, 3.025 g/L and 3.425 g/L, meanwhile the contents of Fe, Zn and Ca in Chlorella were 0.688 mg/g, 0.131 mg/g and 0.125 mg/g, respectively. In addition, the fed-batch culture of heterotrophic Chlorella was studied in 500 L bioreactor, the cell-density of heterotrophic Chlorella was 57.000 g/L. And the contents of Fe, Zn and Ca in Chlorella were 0.128 mg/g, 0.051 mg/g and 0.585 mg/g, respectively. The results were useful for developing a new kind of algal food with the value of medicine and health care and having an considerable social and economic benefit.
Key words: heterotrophic; Chlorella; bioenrichment; metal element; fed-batch culture
微量元素是人体必需的营养物质，对维持人体健康、生长和正常新陈代谢具有重要作用。

小球藻含有丰富的蛋白质、维生素、多糖、类胡萝卜素和微量元素等多种营养物质，可用作抗疲劳和营养强化功能食品[1]。

但目前小球藻在异养条件下可实现高细胞密度培养和高效富集微量元素，当前对藻类富集微量元素的研究主要集中在硒、碘和锌等元素[2]，对铁和钙等对人体重要的微量元素的富集研究少有报道。

本文研究了小球藻在异养条件下对铁、锌和钙的富集条件，并在中试条件下实现了小球藻对铁、锌和钙的富集。

1 材料和方法
收稿日期：2010-08-10
基金项目：科技部“十一五”科技支撑计划子课题（2006BAD27B03）；广州市科技计划项目（2005Z3-E0331）
作者简介：陈俊辉（1985-），硕士研究生
通讯作者：魏东（1966-），男，博士，教授，主要从事工业生物技术、生物化工的研究和开发1.1 藻种和培养基
小球藻Chlorella protothocoides CS-41从CSIRO Marine Laboratory (Hobart, Australia ) 购得。

小球藻种子培养基采用改良的Basal培养基[3]，碳源为葡萄糖（质量浓度为10 g/L），氮源为尿素（质量浓度为1.12 g/L），。

培养基在116 ℃灭菌20 min，尿素采用水相纤维素膜（0.45 μm）单独过滤除菌。

1.2 摇瓶培养富集微量元素
250 mL三角瓶中装入培养基100 mL，接入新鲜斜面藻苔，在28 ℃、160 r/min的下培养3 d后，作为小球藻种子液。

在250 mL三角瓶中装入培养基100 mL，灭菌后种子液接种量为10%，并分别向培养基中添加18 mmol/L的FeSO4·7H2O母液、30 mmol/L的ZnSO4·7H2O母液和75 mmol/L的CaCl2·2H2O母液0.5、1、2、3和4 mL，使培养基中铁离子浓度分别为0.090、0.180、0.270、0.360和0.450 mmol/L；锌离子浓度为0.150、0.300、0.450、0.600 和0.750 mmol/L；
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钙离子浓度为0.375、0.750、1.125、1.500和1.875 mmol/L。

培养3 d后，收集小球藻细胞，分别测定小球藻的生物量和胞内金属离子含量。

1.3 500L补料分批培养中小球藻富集金属离子
在500 mL摇瓶中装入培养基200 mL，灭菌后在温度为28 ℃和转速为160 r/min的条件下进行异养小球藻的培养，3 d的培养液作为小球藻一级种子液。

在50 L发酵罐中，按5%的接种量接入一级种子液，使得培养基总体积为35 L，在28 ℃和160 r/min的条件下培养3 d后，作为小球藻二级种子液。

小球藻在500 L发酵罐中进行补料分批培养，按20%（v/v）接种量接入二级种子液，使起始培养体系为175 L。

培养过程中，温度控制在28±0.5 ℃，采用6 mol/L HCl或NaOH控制pH在6.5±0.2，通过增加转速和加大通气量控制溶氧在50%以上。

培养基中初始葡萄糖浓度为20 g/L，尿素浓度（g/L）与葡萄糖浓度（g/L）之比为1:8.9，定时取样测定生物量和残糖变化情况。

当残糖低于8 g/L时，开始流加补料培养基，保持培养基中葡萄糖浓度在8~12 g/L以内。

补料培养基中葡萄糖浓度为500 g/L，其它组分浓度均为基本培养基的25倍，其中铁、锌和钙三种金属离子的浓度分别为4.500、7.500和18.750 mmol/L。

1.4 分析与测试
1.4.1 小球藻生物量测定
采用干重法测定[4]。

吸取2 mL小球藻培养液置于预先烘干称重的离心管中，6000 r/min离心5 min，弃去上清液。

加入少量蒸馏水，振荡洗涤离心，除去上清液，重复3次。

将离心管敞口放入烘箱中，60 ℃烘干至恒重，测定总重并计算差值，得到小球藻生物量。

每个样品做3个重复，计算其平均值。

1.4.2 小球藻胞内铁、锌和钙含量测定
准确称取0.1 g藻粉，按照食品中铁、锌和钙的国标测定方法（GB/T 5009.90-2003，GB/T 5009.14-2003和GB/T 5009.92-2003）进行小球藻藻粉的硝化处理，并采用V arian spectrAA 220FS型火焰原子吸收光谱仪分析小球藻胞内铁、锌和钙三种不同金属离子的含量。

1.5 数据处理与分析
利用Microsoft Office Excel 2003进行数据处理和分析，分别采用单因素方差分析和平均值的成对二样本t-检验来分析实验数据的显著性。

2 结果和讨论
2.1 胞外铁浓度对异养小球藻生长和胞内铁含量的影响
胞外铁离子浓度对异养小球藻生物量及胞内铁含量的影响如图1所示。

通过单因素方差分析的F检验可知，胞外铁离子浓度对于异养小球藻的生长和胞内铁含量都有极显著的影响（P<0.01）。

随着培养基中铁离子浓度的增加，小球藻生物量略有减少之后开始增加。

Basal培养基（对照）中铁离子的正常浓度为0.180 mmol/L，当提高铁离子浓度到0.450 mmol/L时，可达到小球藻最高的生物量3.000 g/L，显著高于对照（P<0.05）。

其它铁浓度下小球藻生物量增加不显著。

由此可见，提高铁离子浓度对于小球藻的生长有促进作用的，当胞外铁离子浓度保持在0.360 mmol/L以上时，小球藻生物量同对照相比有显著增加(P<0.05)。

同时，随着胞外铁离子浓度的升高，小球藻胞内铁含量也增加。

当胞外铁离子浓度达到0.360 mmol/L时，小球藻胞内铁的含量最高达到0.688 mg/g，显著高于对照（P<0.05）。

继续增加铁离子浓度，小球藻对铁的生物富集作用则会显著地下降（P<0.05）。

由此可见，培养基中铁离子浓度在合适的浓度范围之内，小球藻对铁的生物富集作用可达到最大。

图1 胞外铁离子浓度对异养小球藻生物量和胞内铁含量影响 Fig.1 Effect of external Fe2+ concentration on the growth and intracellular Fe2+ content of heterotrophic Chlorella
综合考虑胞外铁离子浓度对于异养小球藻的生物量和胞内铁含量的影响，保持培养基中铁离子浓度在0.360 mmol/L时，一方面可以促进异养小球藻细胞生物量的增加，另一方面可以实现异养小球藻对铁元素的有效生物富集。

前人研究表明，小球藻细胞内叶绿体光合电子传递链和线粒体的呼吸电子传递链都需要有铁的参与，因此光合作用和呼吸作用等基础代谢过程是铁的直接作用位点。

增加铁离子浓度可以使小球藻胞内的脂含量提高了7倍，主要是中性脂增加，脂类含量高达干物质质量的50%以上[5]。

此外，不同形态的铁对海水小球藻生长有影响，其中Fe2+、Fe3+及二者的EDTA 有机络合态铁和胶体水合氧化铁都能促进小球藻的生
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长速率和叶绿素含量，但前者促进效果更好[6]。

2.2 胞外锌浓度对异养小球藻生长和胞内锌含量的影响
图2 胞外锌离子浓度对异养小球藻生物量和胞内锌含量影响 Fig.2 Effect of external Zn 2+ concentration on the growth and
intracellular Zn 2+ content of heterotrophic Chlorella
胞外锌离子浓度对异养小球藻生物量和胞内锌含量的影响如图2所示。

通过单因素方差分析的F 检验可知，胞外锌离子浓度对于小球藻生长和胞内锌含量都有极显著的影响（P<0.01）。

Basal 培养基（对照）中锌离子的正常浓度为0.300 mmol/L 。

如图2所示，随着培养基中锌离子浓度增加到0.450 mmol/L 时，小球藻生物量达到最大值为3.500 g/L ，显著高于对照（P<0.05）。

之后继续提高锌离子浓度，生物量略有减少，但变化不显著。

同时，锌离子浓度从0.150 mmol/L 提高到0.450 mmol/L 时，小球藻对锌的富集作用显著提高（P<0.05）。

在0.600 mmol/L 时，小球藻胞内锌含量最高达到0.131 mg/g ，显著高于对照（P<0.05）。

在提高锌离子浓度，小球藻胞内锌含量显著下降（P<0.05）。

由此可见，当胞外锌离子浓度处于合适的范围之内时，对小球藻的生长是有促进作用的，过低或过高对于小球藻的生长都有一定的影响。

控制培养基中锌离子的浓度对于小球藻胞内锌的生物富集有着积极的意义。

由此可见，综合考虑胞外锌离子浓度对小球藻生物量和胞内锌含量的影响，培养基中锌离子的最适浓度保持在0.600 mmol/L 左右，小球藻生物量可以达到3.025 g/L ，与最大生物量差异不显著；同时胞内锌含量最高可以达到0.131 mg/g 。

锌也是藻类生长代谢必需的微量元素，过高浓度的锌离子会影响小球藻胞内色素比率，并且会导致渗透率下降，形态发生变异[7]。

在多种藻细胞内，锌可以诱导植物螯合肽的产生，并且随着锌离子浓度增加到一定程度，可以诱导产生核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶以及H3组蛋白[8]，进而影响到藻类的代谢过程。

2.3 胞外钙浓度对异养小球藻生长和胞内钙含量的影响
不同胞外钙离子浓度对异养小球藻生物量和胞内钙含量的影响如图3所示。

通过单因素方差分析的F 检验可知，胞外钙离子浓度对于小球藻生长和和胞内钙含量都有极显著的影响（P<0.01）。

Basal 培养基（对照）中钙离子的正常浓度为0.750 mmol/L 。

如图3所示，随着培养基中钙离子浓度的增加，小球藻生物量先略有减少，变化不显著，之后则开始缓慢地增加。

当提高钙离子浓度到1.500 mmol/L 时，小球藻生物量最高达到3.4 g/L ，显著高于对照（P<0.05）。

继续提高胞外钙离子浓度，但小球藻生物量并没有显著增加。

同时，随着钙离子浓度的增加，小球藻胞内钙含量先有显著下降（P<0.05），之后则不断地增加，当钙离子浓度达到1.500 mmol/L 时，小球藻胞内钙含量最高达到0.125 mg/g ，显著高于对照（P<0.05）。

之后增加胞外钙离子的浓度到1.875 mmol/L ，小球藻对钙的生物富集作用则会有显著降低（P<0.05）。

由此可见，增加钙离子浓度对于小球藻的生长是有促进作用的，但超过1.500 mmol/L 时，对小球藻生物量增加存在有一定的抑制作用。

培养基中钙离子浓度对于小球藻胞内钙含量有着较大的影响。

综合考试虑钙离子浓度对小球藻生物量和胞内钙含量的影响，培养基中钙含量应当保持在 1.500 mmol/L 时左右，此时小球藻生物量最高达到3.400 g/L ，胞内钙含量同时达到最高值0.125 mg/g 。

当培养基中钙离子浓度高于该值后，小球藻对钙的生物富集能力会有极显著降低（P<0.05）。

图3 胞外钙离子浓度对异养小球藻生物量和胞内钙含量影响 Fig.3 Effect of external Ca 2+ concentration on the growth and
intracellular Ca 2+ content of heterotrophic Chlorella
钙等二价阳离子可以促进微藻对氨基酸的吸收，并且影响细胞膜的通透性，而在共生小球藻中，钙离子却没有影响细胞通透性，但是影响小球藻对丝氨酸的吸收[9]。

此外，淡水中钙离子可以与重金属离子竞
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争小球藻细胞表面的结合位点，有效减轻重金属对小球藻的毒害[10]。

2.4 中试发酵中异养小球藻的生物量增长和富集微量元素
在500 L 发酵罐中进行小球藻的补料分批培养，培养过程中生物量和葡萄糖变化趋势如图4所示。

培养起始时，为了缩短生长延滞期，增大小球藻接种量为20%，此时培养基中小球藻生物量为1.650 g/L ，葡萄糖浓度为20 g/L 左右。

由图中可知，小球藻培养过程中延滞期比较短暂，之后小球藻细胞生长进行入对数期，葡萄糖开始大量消耗，小球藻生物量开始逐渐增加，葡萄糖浓度不断降低。

当葡萄糖浓度低于8 g/L 时，开始补加补料培养基，控制葡萄糖浓度在8 g/L~20 g/L 之间。

培养前期，小球藻生物量较低，葡萄糖浓度基本可以控制在这个范围。

培养后期由于生物量较大，加之流加后培养体系不断地增大，葡萄糖浓度降低较快。

培养到158 h 时，小球藻生物量达到最大值为59 g/L ，之后继续培养一段时间，小球藻生物量略有下降。

培养192 h 时，小球藻流加培养结束，小球藻生物量达到57g/L 。

通过分析可知，小球藻藻粉中铁、锌和钙三种金属离子的含量分别为：0.128、0.051、0.585 mg/g ，而培养基中铁、锌和钙三种微量元素的终浓度分别为6.400、3.720和15.720 mmol/L 。

通过计算可知，异养小球藻对培养基中铁、锌、钙三种微量元素的生物富集量占培养基中总含量的2.040%、1.200%和5.300%，大部分微量元素并未被异养小球藻生物富集到细胞内部。

图4 在500L 发酵罐补料分批培养过程中小球藻生物量和葡萄
糖变化趋势
Fig.4 Biomass and glucoss consumption of heterotrophic
Chlorella in fed-batch culture in 500L bioreactor
Shi 等在30 L 生物反应器中对异养小球藻进行补料分批培养，达到45.8 g/L 生物量[11]。

Wu 等利用人工神经网络模型对异养小球藻C.pyrenoidosa 的流加培养进行了研究，最高可以达到121.6 g/L 的细胞密度[12]。

这表明对异养小球藻进行补料分批培养可以实现小球藻的高
密度培养，并且缩短培养时间，生产过程易于控制，这为异养小球藻的规模化生产奠定了基础。

异养小球藻对于不同的微量元素有着不同的富集能力，这主要是由于藻类细胞所特有的细胞结构所决定的。

藻类对微量元素的富集过程一般包括两个步骤：生物吸附过程和主动运输过程。

同前者相比，主动运输过程缓慢且依靠能量，与代谢过程有关[13]。

本研究表明，小球藻对不同金属离子的生物富集作用是不同的，排序为Ca>Fe>Zn 。

但是在中试培养过程中，小球藻对于锌和铁的生物富集作用要明显降低。

适当提高铁和钙离子的浓度对于提高小球藻生物量和生物富集作用有着较好的促进作用。

由于小球藻对于锌有着不同的耐受性，选择不同的锌离子浓度对于小球藻的生物富集作用有着较大的影响，较低或较高的浓度都不利于小球藻的生长和生物富集。

因此在中试培养过程中，锌离子的浓度应当适当控制在40 mg/L 左右。

铁、锌和钙都是人体内必需的微量元素，参与到人体的生理代谢活动，是生物大分子活性物质的配体。

但微量元素在自然界中是以无机态存在的，难以被人体吸收利用。

利用藻类对铁、锌和钙等微量元素进行吸收，参与到糖、脂和蛋白质等代谢中，可以使藻类胞内富集活性很高的有机态微量元素[1]，从而将无机态微量元素转化为有机态微量元素。

据研究表明，增加培养基中铁、锌和钙的浓度也可以提高小球藻胞内总脂含量[14]。

其中钙离子在代谢过程中参与糖代谢和氮代谢, 通过生物转换作用鳌合在多糖蛋白分子上, 成为多糖蛋白赘合钙[15]，从而转化为稳定性好和易被人体吸收的有机态钙。

目前小球藻对微量元素的生物富集机理尚不清楚，对于微量元素浓度对小球藻生物量和胞内生物富集作用值得进一步的研究讨论。

3 结论
本文通过单因素实验发现，胞外铁、锌和钙三种金属离子浓度影响小球藻生长的最适浓度不同，生物富集作用最大时的相应浓度也不同，且生物量和富集能力处于最佳时，相应的金属离子浓度并不一致。

在保证培养基中铁、锌、钙金属离子浓度基础上，对异养小球藻进行补料分批培养可以实现小球藻的高密度培养，同时可以实现铁、锌、钙在小球藻胞内的有效生物富集。

这为开发新型富集微量元素的小球藻功能食品建立了可行的技术体系。

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