葡萄糖氧化酶

3.葡萄糖氧化酶的生产方法
一.（１）葡萄糖氧化酶粗酶液的获得：①高含量的葡萄糖氧化酶发酵液 获取：挑取长满可产葡萄糖氧化酶点的青霉菌菌苔，在一级培养基中 30～32℃振荡培养24ｈ；然后以２～３％接种量 接种于二级培养基中， 30～32 ℃振荡培养24ｈ；最后以２～３％接种量接种于内有三级培养基 的发酵罐中，控制溶氧为 60 ％以上，ｐＨ保持在 6.0 ～ 7.0 之间，发酵 36～48ｈ即可得到酶活为7.0Ｕ以上的葡萄糖氧化酶发酵液；②发酵液离 心浓缩处理：对发酵液进行离心处理，8000ｒｐｍ，20ｍｉｎ，收取上 清液，微滤去除残留的微小颗粒及菌体，超滤浓缩，直至酶活达到 20Ｕ 以上的葡萄糖氧化酶发酵；（２）葡萄糖氧化酶的提纯及脱盐:４℃条件 下，向超滤浓缩酶 液体中缓缓加入硫酸铵固体颗粒，直至形成90％硫酸 铵溶液，盐析４～６ｈ，12000ｒ／ｍｉｎ离心得沉淀，用ｐＨ7.0的Ｔ ｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲溶液收取沉淀蛋白，加去离子水稀释８～ 10倍，超 滤脱盐浓缩处理；（３）形成葡萄糖氧化酶冻干成品：加入保护剂于－ 20℃条件下冷冻真空干燥48小时，即得到葡萄糖氧化，提高机体免疫力 葡萄糖氧化酶催化生成的葡萄糖酸，降低了胃肠内pH值， 为乳酸菌生长制造了酸性环境。有益菌增殖形成微生物竞争优 势，避免肠道菌群在生态上比例失调、定位转移、血行感染， 具有营养作用，参与氨基酸代谢，合成维生素B1、B2、B6、 B12、叶酸及维生素K等，在一定程度上抑制大肠杆菌，控制 感染，排除腐败物质，提高巨噬细胞活性，提高机体免疫力。 2.1-3 解除肠道霉菌毒素中毒，解除饲料霉菌超标危害 葡萄糖氧化酶能增进肝脏中微粒体的氧化作用，对霉菌毒 素进行生物学转化，通过分裂霉菌毒素的功能性原子组，将毒 素降解为无毒代谢物，被机体迅速排出。并可解除霉菌及其毒 素造成的肝肿大、胸腺萎缩、巨噬细胞受到的毒害和免疫抑制。
直到1928年，Muller首先从黑曲霉的无细胞提取液中发现葡萄糖 氧化酶，并研究了其催化机理才正式将其命名为葡萄糖氧化酶，将其 归入脱氢酶类。此后Nakamatsu、Fiedurek、Rogalski等先后对此做了 大量研究工作并投入生产。中国从20世纪70年代开始成立了葡萄糖氧 化酶研究协作组，对其展开了系统研究工作。目前国外的葡萄糖氧化 酶生产厂家主要是德国的Boehringer和日本的Toyobo。近年来国内外 多位学者对葡萄糖氧化酶的作用机理、酶学性质、酶固定化、基因克 隆表达等方面做了大量工作取得了明显进展。
2.2葡萄糖氧化酶开创一种全新的动物保护模式 我们知道，无论哪一种控制病原菌生长的防病措施，都有一个 防卫限度。当病菌数量多到足以突破某种防病措施的防卫限度时， 动物发病。此时，传统的使用药物防病保健放的方式就没有其他办 法了。葡萄糖氧化酶则不同，首先提升机体自身的防御功能，使防 卫限度提高，其次，即使病菌突破了葡萄糖氧化酶的防卫限度，导 致畜禽感染，它的其它功效还在继续尽力维护着机体健康。其一， 葡萄糖氧化酶改善消化吸收的功效还在持续发挥着作用，较好的保 持畜禽发病期间的采食，使畜禽有充足的营养抵抗疾病；其二，葡 萄糖氧化酶保持肠道菌群平衡的功效还在持续发挥作用，某些疾病 引起的腹泻不至于过分严重，使动物体质不至于快速下降；其三， 葡萄糖氧化酶抗氧化的功效还在持续发挥作用，较好的保持机体细 胞完整，使病菌侵害细胞的速度减缓、侵害程度减轻；其四，葡萄 糖氧化酶解除霉菌毒素的功效还在持续发挥作用，霉变饲料产生的 毒素不会对病弱畜禽造成更严重的危害。
2.1-4消除肠道病菌生存环境，减少沙门氏菌等感染 葡萄糖氧化酶可以改善肠道酸性消化环境，催化葡萄糖生成 的葡萄糖酸，在肠道内发挥酸化剂作用，创造酸性环境，降低胃 中pH值，激活胃蛋白酶，促进矿物质和维生素A、D的吸收，并 且酸性肠道环境可减少有害菌，减少腹泻；当葡萄糖氧化酶催化 葡萄糖去除肠道内氧气后，为厌氧有益菌——双歧杆菌的增殖制 造了厌氧环境，这种厌氧环境又不利于需氧菌有害菌——大肠杆 菌、沙门氏菌等存活。
葡萄糖氧化酶
生物132班何岚
1.葡萄糖氧化酶的介绍
葡萄糖氧化酶（Glucoseoxidase，E.C.1.1.3.4,简 称GOD）能够在有氧气的条件下专一性催化β －Ｄ－葡萄 糖生成葡萄糖酸和过氧化氢，其主要成分为β -D-葡萄糖 氧化还原酶，辅基为黄素腺嘌呤二核苷酸。它广泛地分布 于动物、植物和微生物体内，但由于微生物具有生长繁殖 速度快，来源广等特点使之成为葡萄糖氧化酶的主要来源， 微生物中的主要生产菌株为黑曲霉和青霉。 葡萄糖氧化酶广泛应用于食品、饲料、医药等行业中， 起到了去除葡萄糖、脱氧、杀菌等作用。早在1904年人们 就发现了葡萄糖氧化酶，但由于当时对其商业价值认识不 足没有引起人们的足够注视。
二. (1)以橘青霉(Penicillium citrinum Thom.)为出发菌株，用无菌水进行 洗脱，稀释得到橘青霉孢子悬液； (2)挑取步骤(1)获得的橘青霉孢子悬 液接种于斜面培养基，置于恒温箱中放大培养，培养条件为： 28～32℃， 2～5天；(3)将步骤(2)培养得到菌种用无菌水进行洗脱，得到孢子悬浮 液；(4)挑取步骤(3)获得孢子悬浮液接种于固体发酵培养基，接种量为 10％～20％(v/v)，将固体发酵培养基置于摇床中震荡培养，可得到葡萄 糖氧化酶发酵液。(5)将发酵液进行离心、超滤浓缩除盐，得到葡萄糖氧 化酶粗酶液；(6) 将步骤(5)所得粗酶液经甲醇、丙酮相结合二次沉淀， 过滤，滤饼冻干，即得到葡萄糖氧化酶制品。
2.3-1葡萄糖氧化酶在食品中的应用
葡萄糖氧化酶在食品领域具有广泛的应用价值，特别是在葡萄酒喝 啤酒领域。在红葡萄酒中通过添加葡萄糖氧化酶可以将葡萄糖氧化成葡 萄糖酸内酯，在消耗氧气的同时也产生过氧化氢，过氧化氢本身就是一 种杀菌剂，同时由于此反应消除了残留的氧气，这样就在一定程度上降 低了杂菌的污染，提高了葡萄酒的货架期，保持了色泽和风味的稳定性。 葡萄糖氧化酶在啤酒中的应用原理和葡萄酒中相似，它的主要作用也是 去除啤酒中溶解的氧。因为啤酒中氧气的存在一方面会导致啤酒的色泽 加深以及氧化变质，还会为微生物的成长提供便利条件，降低保存期。 通过添加无毒副的葡萄糖氧化酶可以明显降低啤酒的老化，延长其保存 期。葡萄糖氧化酶在果汁保鲜和茶叶保鲜以及对虾保鲜等中的应用原理 与上相同。在小麦粉和玉米粉中添加葡萄糖氧化酶可以提高面粉的筋力， 其作用是通过葡萄糖氧化酶在氧化过程中产生的过氧化氢氧化了面筋蛋 白中的巯基，形成二硫键，增强了面团的网状结构形成的。
分析测试学方面 ：武汉轻工大学化学与环境工程学院的余祎，喻玖宏 俩位导师在2015年2月25日发表了《葡萄糖氧化酶在水溶性CdTe量子点 上的直接电化学研究》一文，利用合成的Cd Te量子点(QDs)作修饰材 料,将葡萄糖氧化酶(GOD)固定在水溶性Cd Te量子点表面,制备了葡萄 糖氧化酶Cd Te量子点修饰碳糊电极(GOD/Cd Te/CPE),实现了GOD在电 极表面的直接电化学。Cd Te QDs能有效地加速葡萄糖氧化酶(GOD) 与 电极表面的直接电子转移,电子传递效率比无QDs Cd Te存在时提高约8 倍 ; 电子转移速率常数 (K) 为 0.14 s-1, 传递系数 ( α ) 为 0.60,GOD 在 GOD/Cd Te/CPE 表面的平均覆盖量 ( Γ ) 为7.9 × 10-8mol/cm2 。GOD/Cd Te/CPE电极作为第三代葡萄糖电化学生物传感器,成功应用于葡萄糖浓 度的检测,其线性范围为0.050~0.32 mmol/L,检出限为0.020 mmol/L。 GOD/Cd Te/CPE的制备方法简单,稳定性强,具有优良的选择性和重现性, 且响应速度快。
2)屠宰性能:21日龄试验组肉鸡屠宰率、全净膛率、半净膛率显著高于 对照组(P<0.05),分别提高2.35%、4.11%和3.23%,42日龄肉鸡屠宰指标 在试验组与对照组之间无显著差异(P>0.05)。3)免疫器官指数:21日龄 时,试验组肉鸡法氏囊指数显著高于对照组 (P<0.05),脾脏指数和胸腺 指数在2组之间无显著差异(P>0.05);42日龄时,试验组肉鸡胸腺指数显 著高于对照组(P<0.05),脾脏指数和法氏囊指数略有提高(P>0.05)。4) 血清指标 :21 日龄时 , 试验组肉鸡血清总蛋白含量显著高于对照组 (P<0.05);42 日龄时 , 试验组肉鸡血清球蛋白含量显著高于对照组 (P<0.05)。在肉鸡21、42日龄时,试验组血清尿素氮含量显著低于对照 组(P<0.05)。综上,肉鸡饲粮使用含葡萄糖氧化酶和酵母硒的混合添加 剂,能够提高肉鸡生产性能,降低死亡率,提高免疫器官指数和降低血清 尿素氮含量。
4.葡萄糖氧化酶的最新进展
食品科技方面：工业发酵微生物教育部重点实验室天津科技大学生物 工程学院的贺玉兰，毛淑红，魏萍萍，路福平四位导师在2015年4月 20日发表了《葡萄糖氧化酶与过氧化氢酶的共固定化研究》这一文章， 研究了环氧树脂在共固定化葡萄糖氧化酶 (GOD)和过氧化氢酶(CAT) 中的应用,利用筛选出固定化效果最好的环氧树脂 ES-4,考察加酶量、 p H及磷酸钠缓冲液离子浓度对共固定化效果的影响。结果表明:共固 定化的最佳条件是:GOD 0.5 m L、CAT 1.0 m L、磷酸钠缓冲液p H6.5、浓度1.0 mol/L,固定24 h后固定化葡萄糖氧化酶酶活回收率为 35%,过氧化氢酶酶活回收率为 43%。连续操作15批次后,酶活力仍能 保持初始酶活的73%。该研究为工业化利用固定化酶生产葡萄糖酸钠 提供了新的思路。
2.3-2 葡萄糖氧化酶在饲料中的应用 葡萄糖氧化酶早在1999年就被国家农业部批准为12种允许使用的 饲料添加剂之一，饲料中添加的葡萄糖氧化酶具有抗氧化的作用，能 够清楚牲畜在应激状态时肠道上皮细胞产生的大量自由基，保护肠道 上皮细胞的完整。在胃肠道中葡萄糖氧化酶不断的氧化葡萄糖成葡萄 糖酸，降低了肠道的pH值，偏酸性环境更有利于保持各种消化酶的生 物活性，有助于饲料的消化。同时偏酸性的环境也有利于益生菌的生 长繁殖，使其处于优势地位，从而抑制了病原微生物的存活，提高了 牲畜自身的免疫力。葡萄糖氧化酶能够抑制多种霉菌，对黄曲霉毒素B 中毒有很好的预防效果，葡萄糖氧化酶不仅能与抗生素等抗菌药物配 伍，而且还有协同药物提高疗效的作用，能够耐受质粒高温。随着葡 萄糖氧化酶制备提纯工艺的不断发展完善，使用成本的不断降低，葡 萄糖氧化酶将在畜牧行业中发挥越来越重要的作用。
动物营养学方面：中国农业科学院畜牧兽医研究所动物营养学国家重点实验室 和北京市饲料监察所的邢焕，孙春阳，栾素军，萨仁娜，张宏福，丁美芳六位 导师在2015年4月15日发表了题名为《葡萄糖氧化酶和酵母硒混合添加剂对肉 鸡生产性能和免疫指标的影响》的文章，本文旨在研究以葡萄糖氧化酶和酵母 硒为主要成分的混合添加剂,在规模化养殖条件下,对肉鸡生产性能、免疫器官 指数和血清蛋白指标的影响。将5 000只1日龄爱拔益加(AA)肉鸡,随机分为2个 组,分别为对照组和试验组,每个组设4个重复,每个重复625只鸡。对照组饲喂玉 米-豆粕基础饲粮,试验组饲喂基础饲粮+0.2%混合添加剂(葡萄糖氧化酶和酵母 硒)。试验期为42 d。结果表明,1)生产性能:在肉鸡不同日龄阶段(1~21日龄、 22~42日龄和1~42日龄),试验组的平均日采食量 (ADFI) 、平均日增重(ADG) 均 显著高于对照组(P<0.05),ADFI分别提高了2.58%、1.55%和1.83%,ADG分别提 高了1.67%、6.93%和6.66%;试验组料重比(F/G)显著低于对照组(P<0.05),分别 降低了3.36%、5.13%和4.44%。在肉鸡生长全期(1~42日龄),试验组肉鸡死亡 率显著低于对照组(P<0.05)。
葡萄糖氧化酶的物理性质化学性质
密度:：1.00 g/mL 1at 20 °C
颜色：近白色粉末至棕色液体 溶解性：溶于水，几不溶于乙醇，氯仿和乙醚。
2.葡萄糖氧化酶的用途
2.1-1 保护肠道上皮细胞完整，控制球虫病爆发 葡萄糖氧化酶能催化葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢。 当其在催化肠道内葡萄糖时，需肠道内氧气参与和生产具有 直接抑菌作用的过氧化氢，随着肠道内氧气的去除和过氧化 氢积累到一定浓度时，能够减少多数需氧菌对肠道的侵害， 从而保护肠道上皮细胞完整，减少肠道内球虫的寄生位置。 高度完整的黏膜上皮细胞也能够减少球虫卵囊侵入的数量。