苏云金杆菌高毒力菌株4_0718的快速选育
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2c
达 95% 以上的菌株有 YA( 1) 、 YA( 2) 、 Y37 1( 3) 、 4 0718 和 Y9 1( 2) 等 5 个菌株, 其杀虫率是 原始菌株 7012c 的 7 5 倍。选取 4 0718 菌株经 10 代培养能稳定遗传。其它较好菌株作为微 生物杀虫剂研究和应用的后备菌株。
表2 活虫数 菌株号 24h 48h 72h 对照 Y A ( 1) 4 0718 Y A ( 2) Y 29 ( 1) Y 13 1( 1) 60 53 0 1 0 14 8 0 2 0 0 43 24h 0 100 0 98 2 100 0 76 7 86 7 100 0 96 7 100 0 100 0 7012c复合诱变后杀虫毒力生物测定 活虫数 菌株号 72h 28 1 Y 37 1( 3) Y 9 1( 2) Y 中 . 2( 1) Y 13 1( 3) 7012c 7012c( 6N ) 24h 48h 72h 0 1 3 41 0 0 1 0 5 0 24h 100 0 98 2 100 0 95 0 100 0 31 7 13 3 85 0 98 3 70 0 98 3 100 0 91 7 100 0 死亡率 ( % ) 48h 72h 死亡率 ( % ) 48h 11 7
图
4 0718 菌株选育系谱图
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复合诱变后菌体涂片镜检初筛结果 经过紫外线和二次化学诱变, 增殖培养分离挑取 1083 个突变菌落。从表 1 镜检结果可看
表 1 7012c经 NTG 诱变后菌体镜检的主要类型 菌株号 菌体解体 程度 ( % ) 95 60 80 80 10 未 70 5 50 90 20 芽孢 有 有 有 有 有 无 有 有 有 有 有 伴孢 有 有 有 有 有 无 有 无 有 有 中 伴孢晶体形状 棱形、 不规则四边形 棱形 棱形 棱形、 不规则四边形 棱形 棱形、 椭圆形 棱形 棱形、 椭圆形 棱形 伴孢晶 体大小 中 大 大 大 中 中 大 中 中 芽孢 / 伴孢 60/ 40 55/ 45 60/ 40 80/ 20 70/ 30 50/ 50 50/ 50 80/ 20 90/ 10 菌体变粗 菌体变异
百度文库[ 11]
中国生物防治
第 17 卷
变潜力。同时, 也说明用紫外线和二次亚硝基胍复合诱变方法筛选高毒力速效杀虫菌株是一 种行之有效的方法, 对构建杀虫基因工程菌能提供新的基因资源。经过复合诱变筛选的高毒 力菌株 4 0718、 YA( 1) 、 YA( 2) 和 Y37 1( 3) 四个菌株为微生物杀虫剂生产菌种的轮换及大田 试验提供了重要的供试菌株。 4 0718 高毒力速效杀虫菌株的鉴定、 生物学特性、 发酵条件、 大 田应用试验、 编码杀虫晶体蛋白基因的定位和分子生物学特征的研究将另文报道。 参考文献
以毒力最高的突变株作为下一轮化学诱变的出发菌株。
20 头三龄小菜蛾幼虫为试虫进行生测。以纯培养基液为对照 , 每个菌株 3 次重复。不同菌株 间和同一菌株的不同重复间的试验材料 ( 菜叶、 平皿大小) 一致 , 保持恒定温度 28 为 85% 。每隔 6h 观察小菜蛾幼虫死亡情况。 , 相对湿度
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[ 1] [ 2] [ 3] [ 4] [ 5] [ 6] [ 7] [ 8] [ 9] [ 10] [ 11] 喻子牛 . 苏云金芽孢杆菌制剂的生产和应用 [ M ] . 北京 : 农业出版社 , 1993. 66- 83. 乐超银 , 刘子铎 , 喻子牛 , 等 . 苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因 cry3A 在鳞翅目特异菌株中的表达及杀虫特性 [ J ] . 微生物学报 , 2000, 40( 2) : 139- 142. 夏立秋 , 丁学知 , 莫湘涛 , 等 . 苏云金杆菌高效速效杀虫新菌种的研究 [ A ] . 见: 中国微生物学会编 . 迎接 21 世 纪微 生物学研讨会论文摘要集 [ C] . 北京 : 中国微生物学会 , 2000. 156. 刘云霞 , 张刚应 . 拮抗细菌对 Bt 制剂杀虫效果的影响 [ J] . 中国生物防治 , 1999, 15( 2) : 70- 72. 陈在佴 . 一种从土壤中分离苏云金杆菌的新方法 [ J] . 中国生物防治 , 1996, 12( 2) : 75- 77. Hoft e H , W hitel ey H R . Insecticidal crystal prot ein of Bacil lus t huri ngie nsis [ J] . M icrobiol. R ev. , 1989, 53: 242- 255. 祖若夫 . 微生物学实验教程 [ M ] . 上海 : 复旦大学出版社 , 1993. 177- 190. 微生物所诱变育种组 . 微生物诱变育种 [ M ] . 北京 : 科学出版社 , 1972. 郭三堆 . 植物 Bt 抗虫基因工程研究进展[ J ] . 中国农业科学 , 1995, 28( 5) : 8- 13. Herve G . How does, Bacil l us t huri ngiensis produce so much insect icidal crystal prot ein [ J] . J. of Biotech. , 1995, 177 ( 21) : 6027- 6032. 高影梅 , 李荣森 , 傅建红 , 等 . 杀鞘翅目苏云金杆菌新菌株及其杀虫剂的研究 [ J] . 微生物学报 , 1999, 39( 6) : 515 -520.
收稿日期 : 2000 -11 -30 基金项目 : 湖南省中青年科技基金项目 ( 96 -09) ; 湖南省农业重大攻关项目 ( 99W KY 1004 - 08) 作者简介 : 丁学知 ( 1956 - ) , 女 , 硕士 , 副教授。
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中国生物防治
第 17 卷
1 5 30 1 6
复筛 把初筛菌株用接种环挑取一环于已灭菌的装有 30ml 复筛培养基的 300ml 三角瓶中 , 在 、 150r/ min 恒温振荡培养 36h, 以 7012c作原始对照菌株, 进行毒力测定。根据复筛结果 , 毒力测定 剪取平皿大小的菜叶片浸稀释 250 倍的菌液后晾干, 放入先经高压灭菌的平皿中, 每皿放
第4期
丁学知等 : 苏云金杆菌高毒力菌株 4 0718 的快速选育
未形成芽孢。7012c 原始菌株伴孢呈棱形 , 诱变后的菌株的伴孢晶体除棱形外, 还有椭圆形和 不规则四边形。伴孢晶体蛋白大小及形状不一样 , 诱变后编码伴孢晶体蛋白的基因可能发生 了改变, 基因的变异将引起杀虫晶体蛋白结构和功能的变化 , 导致了杀虫效力的不同。本试验 中筛选的菌株其伴孢晶体 与芽孢的 比例较接 近的有 4 0718 、 YA ( 1) 、 YA ( 2) 、 Y37 1( 3) 和 Y9 1( 2) 等 5 个菌株, 相差较大的有 Y29 1( 1) 和 Y 中. 2( 1) 两个菌株。 试验中在菌落形态、 颜色、 透明度、 光泽等生物学特征差异不大的情况下, 筛选高毒力杀虫 菌株最可靠的方法是毒力测定。而全部用毒力生测方法筛选高毒力菌株, 存在着很大的盲目 性, 因为在产生正诱变株的同时 , 大量负诱变会给筛选工作带来较多的人力、 物力和时间上的 浪费。因此, 试验中力求寻找一种快速简便的筛选方法来提高诱变育种的效率 , 尽可能克服其 盲目性和随机性。试验中根据第一次生测结果, 将菌株分高、 中、 低毒力的菌株进行显微涂片 观察。通过大量镜检观察取得的数据经统计分析, 从中摸索出了一些规律。发现毒力高的菌 株往往在培养 38h 后, 60% ~ 70% 菌体解体 , 芽孢和晶体游离 , 伴孢晶体棱形较大或伴孢晶体 有几种形状 , 在同一条件下染色较深 , 且芽孢与伴孢比例接近 60/ 40 。而毒力低的菌株往往伴 孢较小, 有的菌株只有芽孢而无伴孢, 有的芽孢与伴孢的比例在 70/ 30 以下, 甚至少数菌株在 同一培养条件下未解体。找出了菌株毒力大小与镜检细胞学特征的关系, 在此基础上把这些 经诱变稀释分离转管的菌株先镜检。根据菌体在相同培养条件下的解体程度、 芽孢与伴孢的 有无、 伴孢晶体的形状、 大小、 数量以及芽孢与伴孢的比例 ( 表 1) , 淘汰大部分毒力低的菌株 , 而毒力高的菌株再进行毒力生测复筛, 这样大大加快了我们的筛选速度和筛选效率。 2 3 701 复合诱变菌株毒力测定 经镜检观察 , 对初筛出的菌株再进行毒力生测 , 复筛结果见表 2。在 24h 时杀虫致死率可
结果与分析
高毒力杀虫菌株 4 0718 的选育系谱 以 7012c为出发菌株, 采用紫外线和两次 NT G 复合诱变, 增殖培养后分离纯化转管, 显微
涂片镜检进行初筛, 小菜蛾幼虫毒力生测复筛( 图) 。紫外线正诱变率为 13% , 其中以紫外线 诱变后毒力较高菌株 7012c16( 3) 作为第一次化学诱变的出发菌株, 正诱变率为 30% , 大大高 于紫外诱变的正诱变率; 其毒力是紫外线诱变的 6 4 倍。
Y A ( 1) 4 0718 Y A ( 2) Y 29 ( 1) Y 13 1( 1) Y 18 1( 1) Y 37 1( 3) Y 5 1( 1) Y 9 1( 2) Y 中 2( 1) Y 13 1( 3)
菌体变大
未形成芽孢
出, 原始出发菌株 7012c经物理方法和化学方法诱变后, 分离的菌株间细胞学特征呈现极大差 异。在同一培养条件下, 大部分菌株有不同程度的解体 , 有的解体后既可见芽孢 , 又有伴孢晶 体, 而个别菌株如 Y5 1( 1) 有芽孢, 而无伴孢晶体; 少数菌株如 Y18. 1( 1) 处于营养体阶段 , 还 164
中图分类号: S476+ . 11
苏云金杆菌 ( Baci llus thuri ngiensis, Bt ) 作为微生物杀虫剂的首选菌种, 其成功的推广和 应用 , 很大程度上都依赖于高毒力菌株的选育[ 3~ 5] 。我们从湖南省不同生态区域的旱作
[ 1, 2]
地、 果园和稻田采集的 858 份土样的芽孢杆菌分离物中 , 筛选出 30 株具典型苏云金杆菌菌落 特征的菌株。选取其中一株经紫外线与亚硝基胍 ( NT G) 复合诱变和定向筛选, 获得了一株高 毒力杀虫菌株, 并为高毒力杀虫菌株的选育提供了一种简单和快速的方法。
17( 4) 163~ 166
中国生物防治
Chinese Journal of Biolog ical Control
2001 年 11 月
苏云金杆菌高毒力菌株 4 0718 的快速选育
丁学知, 夏立秋
( 湖南师范大学生命科学学院 , 长沙 410081)
摘要 : 从湖南省不同生态区域的旱作地、 果园和稻田采集的 858 份土样中, 分离筛选出苏云金 杆菌 30 株 。选取一株具典型苏云金杆菌菌落特征和较高杀虫毒力的菌株 7012c 为出发菌株 , 经紫外线和两次亚硝基胍的交替复合诱变, 显微涂片染色镜检, 发现菌体的伴孢晶体的形状 、 大小 、 数量及芽孢与伴孢晶体的比例与杀虫效力密切相关 。以这些特征为参考进行快速初筛 和毒力生测复筛 , 筛选出一株高毒力突变杀虫菌株 4 0718。 该突变株杀虫毒力与原始菌株相 比提高了 7 5 倍 , 在 6 、 12 和 24h 内供试小菜蛾三龄幼虫死亡率分别高达 20% 、 97% 和 100% 。 此菌株的高效速效杀虫毒力经连续 10 代培养能稳定遗传。 关 键 词: 苏云金杆菌; 小菜蛾; 芽孢; 伴孢 ; 复合诱变 文献标识码: A 文章编号: 1005 - 9261( 2001) 04 - 0163 - 04
1
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材料和方法
土样 、 菌株及试虫
[ 5]
从湖南省不同地区采集土样 , 分离菌株在微生物学研究 室进行 ( Pl ut el la xyl ostella ) 三龄幼虫。 1 2 培养基
。试验用虫为小菜蛾
初筛培养基 ( g/ L ) : 蛋白胨 10 0, 牛肉膏 3 0, NaCl 5 0, 固体培养基加琼脂 17 0, pH 7 8 。 复筛培养基( g/ L) : 黄豆饼粉 25 0, 淀粉 5 0, CaCO3 1 0, F eSO4 7H 2 O 0 02, pH7 8。 1 3 诱变处理方法 参照文献[ 6~ 8] 进行。 1 4 初筛 将诱变处理的菌悬液适当稀释, 取 0 1ml 分离培养基上涂平板, 培养 24h, 再挑取单菌落 转管培养, 然后每管涂片染色油镜观察, 选取芽孢与伴孢的比例接近 1 25 1、 伴孢形状为棱形 [ 3] 的菌株作为复筛毒力测定菌株 。
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3
讨论
运用显微镜观察伴孢晶体的大小、 数目、 形态 , 菌体解体程度 , 伴孢晶体和芽孢的有无等指 标可初步确定菌株杀虫毒力的大小 , 其结果与毒力生测结果基本一致 , 从而为大量淘汰诱变处 理后毒力低的菌株、 定向快速筛选提供了一条简单和行之有效的方法。大量筛选时 , 此法与对 伴孢晶体分子量进行电泳分析的方法相比较 , 所用时间短、 耗费低、 效率高。 [ 9, 10] 苏云金杆菌编码杀虫晶体蛋白基因主要位于质粒上 , 诱变能有效地引起基因发生变 异。高毒力菌株 4 0718 与出发菌株 7012c相比杀虫毒力大大提高, 这说明 7012c 具有极大的诱 165
达 95% 以上的菌株有 YA( 1) 、 YA( 2) 、 Y37 1( 3) 、 4 0718 和 Y9 1( 2) 等 5 个菌株, 其杀虫率是 原始菌株 7012c 的 7 5 倍。选取 4 0718 菌株经 10 代培养能稳定遗传。其它较好菌株作为微 生物杀虫剂研究和应用的后备菌株。
表2 活虫数 菌株号 24h 48h 72h 对照 Y A ( 1) 4 0718 Y A ( 2) Y 29 ( 1) Y 13 1( 1) 60 53 0 1 0 14 8 0 2 0 0 43 24h 0 100 0 98 2 100 0 76 7 86 7 100 0 96 7 100 0 100 0 7012c复合诱变后杀虫毒力生物测定 活虫数 菌株号 72h 28 1 Y 37 1( 3) Y 9 1( 2) Y 中 . 2( 1) Y 13 1( 3) 7012c 7012c( 6N ) 24h 48h 72h 0 1 3 41 0 0 1 0 5 0 24h 100 0 98 2 100 0 95 0 100 0 31 7 13 3 85 0 98 3 70 0 98 3 100 0 91 7 100 0 死亡率 ( % ) 48h 72h 死亡率 ( % ) 48h 11 7
图
4 0718 菌株选育系谱图
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复合诱变后菌体涂片镜检初筛结果 经过紫外线和二次化学诱变, 增殖培养分离挑取 1083 个突变菌落。从表 1 镜检结果可看
表 1 7012c经 NTG 诱变后菌体镜检的主要类型 菌株号 菌体解体 程度 ( % ) 95 60 80 80 10 未 70 5 50 90 20 芽孢 有 有 有 有 有 无 有 有 有 有 有 伴孢 有 有 有 有 有 无 有 无 有 有 中 伴孢晶体形状 棱形、 不规则四边形 棱形 棱形 棱形、 不规则四边形 棱形 棱形、 椭圆形 棱形 棱形、 椭圆形 棱形 伴孢晶 体大小 中 大 大 大 中 中 大 中 中 芽孢 / 伴孢 60/ 40 55/ 45 60/ 40 80/ 20 70/ 30 50/ 50 50/ 50 80/ 20 90/ 10 菌体变粗 菌体变异
百度文库[ 11]
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第 17 卷
变潜力。同时, 也说明用紫外线和二次亚硝基胍复合诱变方法筛选高毒力速效杀虫菌株是一 种行之有效的方法, 对构建杀虫基因工程菌能提供新的基因资源。经过复合诱变筛选的高毒 力菌株 4 0718、 YA( 1) 、 YA( 2) 和 Y37 1( 3) 四个菌株为微生物杀虫剂生产菌种的轮换及大田 试验提供了重要的供试菌株。 4 0718 高毒力速效杀虫菌株的鉴定、 生物学特性、 发酵条件、 大 田应用试验、 编码杀虫晶体蛋白基因的定位和分子生物学特征的研究将另文报道。 参考文献
以毒力最高的突变株作为下一轮化学诱变的出发菌株。
20 头三龄小菜蛾幼虫为试虫进行生测。以纯培养基液为对照 , 每个菌株 3 次重复。不同菌株 间和同一菌株的不同重复间的试验材料 ( 菜叶、 平皿大小) 一致 , 保持恒定温度 28 为 85% 。每隔 6h 观察小菜蛾幼虫死亡情况。 , 相对湿度
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[ 1] [ 2] [ 3] [ 4] [ 5] [ 6] [ 7] [ 8] [ 9] [ 10] [ 11] 喻子牛 . 苏云金芽孢杆菌制剂的生产和应用 [ M ] . 北京 : 农业出版社 , 1993. 66- 83. 乐超银 , 刘子铎 , 喻子牛 , 等 . 苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因 cry3A 在鳞翅目特异菌株中的表达及杀虫特性 [ J ] . 微生物学报 , 2000, 40( 2) : 139- 142. 夏立秋 , 丁学知 , 莫湘涛 , 等 . 苏云金杆菌高效速效杀虫新菌种的研究 [ A ] . 见: 中国微生物学会编 . 迎接 21 世 纪微 生物学研讨会论文摘要集 [ C] . 北京 : 中国微生物学会 , 2000. 156. 刘云霞 , 张刚应 . 拮抗细菌对 Bt 制剂杀虫效果的影响 [ J] . 中国生物防治 , 1999, 15( 2) : 70- 72. 陈在佴 . 一种从土壤中分离苏云金杆菌的新方法 [ J] . 中国生物防治 , 1996, 12( 2) : 75- 77. Hoft e H , W hitel ey H R . Insecticidal crystal prot ein of Bacil lus t huri ngie nsis [ J] . M icrobiol. R ev. , 1989, 53: 242- 255. 祖若夫 . 微生物学实验教程 [ M ] . 上海 : 复旦大学出版社 , 1993. 177- 190. 微生物所诱变育种组 . 微生物诱变育种 [ M ] . 北京 : 科学出版社 , 1972. 郭三堆 . 植物 Bt 抗虫基因工程研究进展[ J ] . 中国农业科学 , 1995, 28( 5) : 8- 13. Herve G . How does, Bacil l us t huri ngiensis produce so much insect icidal crystal prot ein [ J] . J. of Biotech. , 1995, 177 ( 21) : 6027- 6032. 高影梅 , 李荣森 , 傅建红 , 等 . 杀鞘翅目苏云金杆菌新菌株及其杀虫剂的研究 [ J] . 微生物学报 , 1999, 39( 6) : 515 -520.
收稿日期 : 2000 -11 -30 基金项目 : 湖南省中青年科技基金项目 ( 96 -09) ; 湖南省农业重大攻关项目 ( 99W KY 1004 - 08) 作者简介 : 丁学知 ( 1956 - ) , 女 , 硕士 , 副教授。
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第 17 卷
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复筛 把初筛菌株用接种环挑取一环于已灭菌的装有 30ml 复筛培养基的 300ml 三角瓶中 , 在 、 150r/ min 恒温振荡培养 36h, 以 7012c作原始对照菌株, 进行毒力测定。根据复筛结果 , 毒力测定 剪取平皿大小的菜叶片浸稀释 250 倍的菌液后晾干, 放入先经高压灭菌的平皿中, 每皿放
第4期
丁学知等 : 苏云金杆菌高毒力菌株 4 0718 的快速选育
未形成芽孢。7012c 原始菌株伴孢呈棱形 , 诱变后的菌株的伴孢晶体除棱形外, 还有椭圆形和 不规则四边形。伴孢晶体蛋白大小及形状不一样 , 诱变后编码伴孢晶体蛋白的基因可能发生 了改变, 基因的变异将引起杀虫晶体蛋白结构和功能的变化 , 导致了杀虫效力的不同。本试验 中筛选的菌株其伴孢晶体 与芽孢的 比例较接 近的有 4 0718 、 YA ( 1) 、 YA ( 2) 、 Y37 1( 3) 和 Y9 1( 2) 等 5 个菌株, 相差较大的有 Y29 1( 1) 和 Y 中. 2( 1) 两个菌株。 试验中在菌落形态、 颜色、 透明度、 光泽等生物学特征差异不大的情况下, 筛选高毒力杀虫 菌株最可靠的方法是毒力测定。而全部用毒力生测方法筛选高毒力菌株, 存在着很大的盲目 性, 因为在产生正诱变株的同时 , 大量负诱变会给筛选工作带来较多的人力、 物力和时间上的 浪费。因此, 试验中力求寻找一种快速简便的筛选方法来提高诱变育种的效率 , 尽可能克服其 盲目性和随机性。试验中根据第一次生测结果, 将菌株分高、 中、 低毒力的菌株进行显微涂片 观察。通过大量镜检观察取得的数据经统计分析, 从中摸索出了一些规律。发现毒力高的菌 株往往在培养 38h 后, 60% ~ 70% 菌体解体 , 芽孢和晶体游离 , 伴孢晶体棱形较大或伴孢晶体 有几种形状 , 在同一条件下染色较深 , 且芽孢与伴孢比例接近 60/ 40 。而毒力低的菌株往往伴 孢较小, 有的菌株只有芽孢而无伴孢, 有的芽孢与伴孢的比例在 70/ 30 以下, 甚至少数菌株在 同一培养条件下未解体。找出了菌株毒力大小与镜检细胞学特征的关系, 在此基础上把这些 经诱变稀释分离转管的菌株先镜检。根据菌体在相同培养条件下的解体程度、 芽孢与伴孢的 有无、 伴孢晶体的形状、 大小、 数量以及芽孢与伴孢的比例 ( 表 1) , 淘汰大部分毒力低的菌株 , 而毒力高的菌株再进行毒力生测复筛, 这样大大加快了我们的筛选速度和筛选效率。 2 3 701 复合诱变菌株毒力测定 经镜检观察 , 对初筛出的菌株再进行毒力生测 , 复筛结果见表 2。在 24h 时杀虫致死率可
结果与分析
高毒力杀虫菌株 4 0718 的选育系谱 以 7012c为出发菌株, 采用紫外线和两次 NT G 复合诱变, 增殖培养后分离纯化转管, 显微
涂片镜检进行初筛, 小菜蛾幼虫毒力生测复筛( 图) 。紫外线正诱变率为 13% , 其中以紫外线 诱变后毒力较高菌株 7012c16( 3) 作为第一次化学诱变的出发菌株, 正诱变率为 30% , 大大高 于紫外诱变的正诱变率; 其毒力是紫外线诱变的 6 4 倍。
Y A ( 1) 4 0718 Y A ( 2) Y 29 ( 1) Y 13 1( 1) Y 18 1( 1) Y 37 1( 3) Y 5 1( 1) Y 9 1( 2) Y 中 2( 1) Y 13 1( 3)
菌体变大
未形成芽孢
出, 原始出发菌株 7012c经物理方法和化学方法诱变后, 分离的菌株间细胞学特征呈现极大差 异。在同一培养条件下, 大部分菌株有不同程度的解体 , 有的解体后既可见芽孢 , 又有伴孢晶 体, 而个别菌株如 Y5 1( 1) 有芽孢, 而无伴孢晶体; 少数菌株如 Y18. 1( 1) 处于营养体阶段 , 还 164
中图分类号: S476+ . 11
苏云金杆菌 ( Baci llus thuri ngiensis, Bt ) 作为微生物杀虫剂的首选菌种, 其成功的推广和 应用 , 很大程度上都依赖于高毒力菌株的选育[ 3~ 5] 。我们从湖南省不同生态区域的旱作
[ 1, 2]
地、 果园和稻田采集的 858 份土样的芽孢杆菌分离物中 , 筛选出 30 株具典型苏云金杆菌菌落 特征的菌株。选取其中一株经紫外线与亚硝基胍 ( NT G) 复合诱变和定向筛选, 获得了一株高 毒力杀虫菌株, 并为高毒力杀虫菌株的选育提供了一种简单和快速的方法。
17( 4) 163~ 166
中国生物防治
Chinese Journal of Biolog ical Control
2001 年 11 月
苏云金杆菌高毒力菌株 4 0718 的快速选育
丁学知, 夏立秋
( 湖南师范大学生命科学学院 , 长沙 410081)
摘要 : 从湖南省不同生态区域的旱作地、 果园和稻田采集的 858 份土样中, 分离筛选出苏云金 杆菌 30 株 。选取一株具典型苏云金杆菌菌落特征和较高杀虫毒力的菌株 7012c 为出发菌株 , 经紫外线和两次亚硝基胍的交替复合诱变, 显微涂片染色镜检, 发现菌体的伴孢晶体的形状 、 大小 、 数量及芽孢与伴孢晶体的比例与杀虫效力密切相关 。以这些特征为参考进行快速初筛 和毒力生测复筛 , 筛选出一株高毒力突变杀虫菌株 4 0718。 该突变株杀虫毒力与原始菌株相 比提高了 7 5 倍 , 在 6 、 12 和 24h 内供试小菜蛾三龄幼虫死亡率分别高达 20% 、 97% 和 100% 。 此菌株的高效速效杀虫毒力经连续 10 代培养能稳定遗传。 关 键 词: 苏云金杆菌; 小菜蛾; 芽孢; 伴孢 ; 复合诱变 文献标识码: A 文章编号: 1005 - 9261( 2001) 04 - 0163 - 04
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材料和方法
土样 、 菌株及试虫
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从湖南省不同地区采集土样 , 分离菌株在微生物学研究 室进行 ( Pl ut el la xyl ostella ) 三龄幼虫。 1 2 培养基
。试验用虫为小菜蛾
初筛培养基 ( g/ L ) : 蛋白胨 10 0, 牛肉膏 3 0, NaCl 5 0, 固体培养基加琼脂 17 0, pH 7 8 。 复筛培养基( g/ L) : 黄豆饼粉 25 0, 淀粉 5 0, CaCO3 1 0, F eSO4 7H 2 O 0 02, pH7 8。 1 3 诱变处理方法 参照文献[ 6~ 8] 进行。 1 4 初筛 将诱变处理的菌悬液适当稀释, 取 0 1ml 分离培养基上涂平板, 培养 24h, 再挑取单菌落 转管培养, 然后每管涂片染色油镜观察, 选取芽孢与伴孢的比例接近 1 25 1、 伴孢形状为棱形 [ 3] 的菌株作为复筛毒力测定菌株 。
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讨论
运用显微镜观察伴孢晶体的大小、 数目、 形态 , 菌体解体程度 , 伴孢晶体和芽孢的有无等指 标可初步确定菌株杀虫毒力的大小 , 其结果与毒力生测结果基本一致 , 从而为大量淘汰诱变处 理后毒力低的菌株、 定向快速筛选提供了一条简单和行之有效的方法。大量筛选时 , 此法与对 伴孢晶体分子量进行电泳分析的方法相比较 , 所用时间短、 耗费低、 效率高。 [ 9, 10] 苏云金杆菌编码杀虫晶体蛋白基因主要位于质粒上 , 诱变能有效地引起基因发生变 异。高毒力菌株 4 0718 与出发菌株 7012c相比杀虫毒力大大提高, 这说明 7012c 具有极大的诱 165