己烯雌酚人工抗原的合成及其抗体制备

己烯雌酚人工抗原的合成及其抗体制备

陈德坤1,郑增忍2,曲志娜2,雷莉辉1,张佩君3　(11西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌712100;

　21农业部动物检疫所,山东青岛266032;31陕西省教育学院生物系,陕西西安710003)

摘要:以己烯雌酚(D ES )、琥珀酸酐和牛血清白蛋白(BSA )等为主要原料,采用混合酸酐反应,首先合成己烯雌酚半琥珀酸酯(D ES 2H S ),经质谱分析鉴定后,再将D ES 2H S 结合到BSA 上,并用SD S 2PA GE 对D ES 2H S 2BSA 进行测定。以D ES 2H S 2BSA 免疫家兔6次,用琼脂双扩散试验测定抗体。试验结果表明,高分辨质谱测得合成的D ES 2H S 分子量为368;BSA 2H S 2D ES 的SD S 2PA GE 图谱经相关软件分析表明,单个BSA 上结合有32个D ES 2H S ;琼脂扩散试验结果证实,免疫兔血清中含有抗D ES 的抗体。本试验为下一步研制D ES 残留免疫检测试剂盒及抗D ES 单抗奠定了基础。关键词:己烯雌酚;琥珀酸酐;牛血清白蛋白;混合酸酐反应;抗D ES 抗体

中图分类号:S 852143 文献标识码:A 文章编号:100524545(2004)0420364203 己烯雌酚(D ES )是一种人工合成的雌激素,在医学临床上普遍用于妇科病的治疗,而且还被用作动物饲料添加剂,以促进动物生长,提高产量[1,2]。国内外大量研究表明[3],己烯雌酚可以破坏机体遗传物质,导致基因突变而引发机体肿瘤。因此,国内外所颁布的食品安全法均规定,动物性产品及食品中不得检出己烯雌酚。目前,国外已经建立了成熟的己烯雌酚残留免疫检测方法,并有相关的诊断试剂盒。目前,国内检测己烯雌酚主要采用高效液相色谱(H PL C )法或气相色谱2质谱(GC 2M S )法。为开发研制具有我国自主知识产权的药物残留(包括己烯雌酚)免疫检测试剂盒,达到能够对批量样品进行快速、准确检测的目的,特进行了本研究。

1　材料与方法

111　主要试剂和仪器　己烯雌酚,纯度99%,美国Sigm a 公

司产品;琥珀酸酐,上海化学试剂公司;氯甲酸异丁酯,CP ,上

海飞详化工厂;三正丁胺,CP ,北京化工厂进口分装;牛血清白蛋白(BSA ),华美生物工程公司;其他试剂均为A R 级。

Z AB 2H S 仪器、FT 2M S A PXX 仪器、

凝胶成像系统(UV P B i o i m aging System )及其分析软件(lab w o rk s 410I m age A c 2

qu isiti on and A nalysis Softw are )。

112　试验动物　成年健康家兔,体质量215kg 左右,购自青

岛医学院试验动物中心。

113　己烯雌酚半琥珀酸酯(D ES -HS )的合成　D ES 2H S 的合成路线如下:

HO

C

C 2H 6

C C 2H 6

OH + O C O

CH 2C

O

C H 2HO

C

C 2H 6C C 2H 6

O

C O

CH 2

CH 2

C O

OH 收稿日期:2003212222

作者简介:陈德坤(19642),男,副教授,博士。

将70m g D ES 溶于5mL 吡啶中,搅拌至完全溶解,再加入琥珀酸酐25m g ,置于通风橱中,在室温下搅拌48h 。反应完成后,将反应液移入30mL 冰蒸馏水与5mL 浓盐酸组成的混合液中静置过夜,抽滤析出的沉淀,并以蒸馏水洗至

pH 515左右,真空干燥,得粗产品。将所得粗产品加入丙酮溶

解后,拌入等量的硅胶,室温下晾干,用200～300目硅胶柱层析分离,用TL C 监测,收集R f =0109(展开剂,石油醚∶丙酮

=3∶1)的点合并,常温下干燥,即得D ES 2H S 纯品。

对该物质进行高分辨质谱测定。

114　D ES -HS -BSA 的合成　将D ES 2H S 2BSA 50m g 溶于二氧六环中,置4℃下10m in ,然后加入20ΛL 三正丁胺,混匀,再加入15ΛL 氯甲酸异丁酯,4℃条件下搅拌30m in ,此为甲液。另取150m g BSA 溶于20mL 的70%二氧六环水溶液中,此为乙液。将甲液与乙液合并,4℃下搅拌过夜,将反应液流水透析2h ,然后换成平衡盐溶液继续透析48h 。浓缩透析液,冷冻干燥。用5%的积层胶和10%的分离胶对D ES 2H S 2BSA 进行SD S 2PA GE 鉴定,通过紫外凝胶成像系统分析软件分析得

出D ES 2H S 2BSA 的分子量,以此为依据推算单个BSA 上结

合D ES 2H S 的数目。

115　D ES -HS -OVA (卵清蛋白)的合成　参照方法114进行。116　动物免疫试验　用无菌生理盐水溶解D ES 2H S 2BSA 后,与等量的弗氏完全佐剂混合,在混合振荡器上充分振荡,使其完全乳化,D ES 2H S 2BSA 的最终含量为1g L 。在家兔脊椎两侧交叉选取6～8个点,做皮下注射免疫,免疫剂量为2

mL

只。20～25d ,进行第2次免疫,免疫途径及免疫剂量同第1次,佐剂为弗氏不完全佐剂。以后,每隔15d 加强免疫1次,免疫剂量均为上次的2倍,免疫途径为皮下注射,免疫时不使用弗氏佐剂。免疫共进行6次,最后1次免疫后10d ,经心脏无菌采血,分离免疫血清。

117　抗D ES 抗体的测定　按照常规的琼脂双扩散试验进行。在1%琼脂糖凝胶上打出梅花孔,挑去孔中琼脂块,用015%融化琼脂封底。向中央孔加入分离的免疫兔血清,周围孔分别加D ES 2H S 2BSA 、OVA 、D ES 2H S 2OVA ,在37℃感作24～48h 后,将琼脂糖凝胶用生理盐水漂洗24h ,用011%考马斯亮蓝染液染色,经脱色后,对琼扩试验结果照相。