酿酒酵母S_cerevisiae高密度培养条件优化研究

　第37卷第1期　2007年2月

工业微生物

Industrial Microbiology

　Vol.37No.1　

Feb.2007

基金项目:厦门市科技计划资助项目(编号:3502Z20031079);作者简介:王颖(1983～),女,硕士研究生;

3通讯作者。Tel :86-592-2183088;Fax :86-592-2184822;E 2mail :ylu @

酿酒酵母S.cerevisiae 高密度培养条件优化研究

王　颖,　何　宁,　李清彪,　邓　旭,　卢英华3

(厦门大学化学工程与生物工程系,厦门361005)

摘　要 考察了培养基组成和培养条件对酿酒酵母S accharom yces cerevisiae 发酵的影响。以TB 培养基为初始培养基,通过正交实验设计优化培养基组成,确定了影响酵母细胞产量最主要的

因素是葡萄糖,最适培养基组成为:酪蛋白胨15g/L ,酵母粉25g/L ,葡萄糖30g/L ,KH 2PO 42.4g/L ,K 2HPO 4・3H 2O 16.34g/L 。并确定了最佳培养条件:温度30℃,转速150r/min 。采用优化

培养基及培养条件下进行发酵,菌液最高OD 600值和细胞密度分别达15.82和2.03×108/mL ,比优化前分别提高24.2%和22.0%。

关键词:酿酒酵母;　培养基;　培养条件;　正交实验 近代基因技术的进步使人们可以利用微生物大量生产高价值的生物药物及其它重组蛋白。发酵产物的多少通常与细胞密度的高低关联,因此发酵过程的首要任务通常是研究如何尽可能地达到高的细胞密度,以便提高生产率、简化下游加工、减少废水排放量、降低培养容积、生产成本及设备投资,使目的产物产生良好的成本效益[1]。

优化培养基是一种提高细胞密度的有效方法。培养基分复合培养基、半合成培养基和合成培养基三种[2]。合成培养基成分和浓度已知且可以控制,常用来获得高细胞密度;复合培养基含有提取物(如蛋白胨,酵母提取物),营养物的成分和质量可能不同,故复合培养基进行发酵过程的重复性较差。然而,复合培养基和半合成培基对促进产物生成是必要的,而且在复合培养基和半合成培基中,细胞生长往往比在合成培基中快[3]。为使细胞生长达到高密度,有必要设计一种含必需成分的平衡性营养培养基,以维持细胞生长,同时避免生长的抑制。 酿酒酵母(S accharom yces cerevisiae )作为人类利用最早的微生物,其营养成分十分丰富,含有菌体蛋白质、多种氨基酸、维生素、脂肪、食物纤维、矿物元素、微量元素及生理活性物质等[4]。由于其具有

安全、生长繁殖快、代谢周期短、容易进行大规模培养、菌体蛋白质丰富等优点,一直是基础和应用研究的主要对象,并被广泛应用于酿造、食品、医药、饲料工业等领域[5]。近年来,世界各国均在积极采用微生物发酵技术开发酵母菌市场。此外,酿酒酵母还是外源基因理想的真核生物表达系统,并与盘基网柄菌 D.discoi deum 一起,于2000年被N IH 选为

标准微生物模型系统(http :///sci 2ence/)。

国内外对酿酒酵母菌培养的实验研究已有了较多的报道。Raj 等采用合成培养基,可获得140g/L 的细胞干重[6]。Park 等在内置膜过滤反应器内连续培养酿酒酵母,得到13g/(L ・h )的细胞干重[7]。赵宝华等探讨了外加Ca 2+、La 3+对酿酒酵母生长的影响[8]。梅乐和等研究了酿酒酵母微囊化培养过程[9]。此外,也有不少研究集中在基因工程和固定化技术于酿酒酵母生产中的应用[10～12]。本文以TB 培养基(一种培养大肠杆菌的简单复合培养基)为基础,考察了培养基成分和浓度,以及培养条件等对酿酒酵母发酵培养的影响,并利用正交实验对培养基进行了优化,开发出了一个适合高密度培养酿酒酵母菌的简单复合培养基。

1　材料和方法

1.1　菌种

酿酒酵母(S accharom yces cerevisiae),由厦门大学生物系提供。

1.2　主要试剂

酪蛋白胨(北京陆桥技术有限责任公司产品),酵母粉(英国OXO ID公司产品),葡萄糖(上海化学试剂站分装厂产品),甘油(中国医药(集团)上海化学试剂公司产品),磷酸二氢钾(上海试剂二厂产品),磷酸氢二钾(汕头市西陇化工厂产品)。

1.3　TB培养基

于800mL蒸馏水中加入酪蛋白胨12g,酵母粉24g,甘油4g;100mL蒸馏水中加入葡萄糖20 g。100mL蒸馏水中加入KH2PO42.4g,K2HPO4・3H2O16.34g。

上述三部分各自溶解,121℃蒸汽灭菌20min,冷却后混合。该培养基作为种子培养基和正交实验优化设计的初始培养基。

1.4　培养方法

1.4.1　摇瓶种子培养

从冷冻甘油管中接种酵母细胞至装有30mL TB培养基的250mL三角瓶中培养,摇瓶转速为200r/min,温度为28℃,培养时间为30h。

1.4.2　摇瓶发酵培养

将上述种子液接入50mL/250mL锥形瓶中,控制接种量使得菌液初始细胞密度为4～6×105/ mL。摇床(28℃、150r/min)培养,每隔3至4h取样测定。

1.4.3　发酵罐分批培养

发酵罐分批培养在美国Cole2Parmer Instru2 ment Company生产的3L发酵罐中进行。在发酵罐中装入2L优化后培养基,接入种子液,控制接种量使得菌液初始细胞密度为4～6×105/mL。温度通过循环水浴控制在30℃,p H值通过自动流加1 mol/L NaOH或5%H3PO4溶液控制p H在7.5。通气速率为2L/(L・min)。搅拌转速为200r/min,当溶氧降至20%以下时,提高搅拌转速以使溶氧恢复至20%。

1.5　正交实验设计

培养基中酪蛋白胨、酵母粉、甘油以及葡萄糖4个因素的浓度对酿酒酵母生长的影响可以利用正交实验进行优化。每个因素取3个水平,采用的四因素三水平正交实验见表1。在28℃,150r/min条件下培养,测定菌液的最大OD600值。

表1　培养基正交实验因素及水平表

水平

Level

A

酪蛋白胨(g/L)

B

酵母粉(g/L)

C

甘油(g/L)

D

葡萄糖(g/L)

151500

21020210

31525420

1.6　分析方法

(1)比浊法测定菌液浓度:将培养液直接或做适

当稀释后,用722型分光光度计(厦门分析仪器厂)

以超纯水为参照测定菌液的吸光度OD600值。

(2)血球计数法测定细胞密度:培养液经适当稀

释,吸取经过适当稀释后的菌悬液,滴至血球计数

板,在显微镜下直接计数。

2　结果与讨论

2.1　发酵培养基的优化实验

通过正交实验对培养基配方进行优化,实验结

果及其极差分析见表2。

表2　正交实验结果及其极差分析

实验号A B C D OD600 11111 1.62

212227.28

313338.92

4212310.30

52231 4.32

6231210.32

7313211.22

8321312.60

93321 5.20

M117.8223.1424.5611.16

M224.9624.1922.8028.84

M329.0624.4924.4631.82

m1 5.947.718.19 3.72

m28.328.067.609.61

m29.688.168.1610.61

R 3.740.440.58 6.89

从表2的实验结果中可看出,在9次实验中以

第8号实验的OD600值最大,高达12.60,相应的水

平组合A3B2C1D3是当前最好的水平搭配。

从表2的极差分析及图1中可以看出,四个因

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