神经干细胞体外诱导分化为胆碱能神经元的研究进展.

神经干细胞体外诱导分化为胆碱能神经元的研究进展

硕士研究生孙晓静导师孙莉

传统的观点认为，“中枢神经细胞不可再生”，然而自1992年Reynolds等从成年鼠脑纹状体和海马中首次分离出了神经干细胞（NSC）,且它与多能干细胞一样具有自我更新、分裂增殖、多向分化的潜能，此后人们开始深入了解神经干细胞。Erikson等于1998年也证实了人脑中同样存在神经干细胞，随后的研究发现成年脑中神经干细胞主要存在于侧脑室外侧壁脑室下区和海马齿状回中。随着近年来对中枢神经系统的损伤或病变部位实行细胞替代或移植治疗的研究深入，为中枢神经系统损伤、神经系统变性疾病或神经退行性疾病等的治疗提供了新的方向。

阿尔茨海默病（AD）是老年人常见的一种慢性进行性神经系统变性疾病。长期以来认为前脑胆碱能投射系统（尤其是Meynert基底核）胆碱能神经元变性、细胞数量减少等导致AD认知功能不可逆的减退。目前就其病因有多种学说：如基因学说（APP基因[ 1 ]、早老蛋白基因[ 2 ] 、ApoE基因[ 3 ] ）、胆碱能假说、雌激素水平下降学说[4] 、氧化应激学说[ 5 ] 、铝中毒学说、炎症学说[6 ] 、神经营养因子学说[7 ] 等。此外，AD还可能与年龄、种族、社会心理因素及各种疾病史等多种因素有关。

综上所述, 多因素参与AD 发病, 但目前为止确切的发病机制尚不清楚。其治疗方法包括对于轻度和中度AD 予以乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制剂以提高认知功能, 以及N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)拮

抗剂对重度AD 的治疗[8],其他药物如脑循环改善药物剂、AChE 抑制剂、M1 胆碱受体激动剂、乙酰胆碱释放促进剂、神经生长因子、抗氧化药物和抗β-淀粉样药物等。这些治疗手段虽能减轻AD 的症状, 但无法补充大脑皮层和海马大量丢失的神经细胞,因而对中、晚期AD 患者的疗效有限。神经干细胞(NSCs)的广泛研究及重大进展为AD 的治疗提供了一个更有前景的治疗策略，NSC移植治疗AD等退行性疾病成为近年来的研究热点。然而不管是诱导、促进内源性NSCs增殖分化，产生相应的神经细胞代替缺损变性的细胞，还是体外培养需要的NSCs移植入体内，如何诱导NSCs定向分化为胆碱能神经元都是一个至关重要的问题。

神经干细胞增殖、分化相关因素

神经干细胞的增殖、迁移、分化与多种因素相关。目前的研究认为决定神经干细胞定向分化的机制有两种：一种是细胞自身基因调控；另一种是外来因素调控，主要为各类细胞因子家族，如神经营养因子、生长因子、细胞黏附因子等均可影响神经细胞的分化，其影响机制各不相同。不同的细胞因子诱导分化出的神经元不同。研究最多有生长因子如：表皮生长因子（EGF）家族、碱性成纤维细胞生长因子（FGF）家族、β-转导生长因子（β-TGF）超家族、神经营养因子、脑源性生长因子及化学诱导剂及药物等。

一、生长因子

碱性成纤维生长因子(FGF)在神经干细胞增殖的早期阶段发挥促有丝分裂的作用, 使神经干组胞获得对另一作用更强的促有丝分裂

因子表皮生长因子（EGF）的反应性;而表皮生长因子在神经干细胞增殖后期发挥作用[9]。两种因子对神经干细胞分化方向的作用也不相同, 碱性成纤维生长因子能增加干细胞向神经元分化的比例, 而表皮生长因子敏感的干细胞生成的神经元常常少于1%, 绝大多数是星形胶质细胞, 且这两种生长因子作用的神经干细胞分化形成的神经元多为γ- 氨基丁酸能神经元[10]。Tarasenko 等[9]比较碱性成纤维生长因子、表皮生长因子和外源性白血病抑制因子联合及单独应用对培养的人胚神经干细胞的影响, 发现上述 3 种生长因子联合应用对人胚神经干细胞的扩增最有效, 人胚神经干细胞在有碱性成纤维生长因子, 肝素及层粘连蛋白的联合作用下往胆碱能神经元方向分化。

二、转化生长因子β超家族

骨形成蛋白是转化生长因子β超家族中最大成员。在原肠胚期, 骨形成蛋白首先表现为抑制神经外胚层的形成; 在神经管期,不同浓度的骨形成蛋白和其他细胞因子共同促进神经管背部不同类型神经细胞的分化; 在发育晚期, 作用于腹侧区的神经前体细胞, 抑制这些细胞分化为神经元及少突胶质细胞, 促进其分化为星形胶质细胞,同时也作用于非腹侧区的神经前体细胞, 促进其存活及分化[11]。骨形成蛋白 2 可以明显抑制Oligr2(促进神经前体细胞向神经元和少突胶质细胞分化的一种重要转录调控因子)的表达, 从而抑制少突胶质细胞分化[12]。V arley 等试验研究证明骨形成蛋白 2 是神经嵴细胞向肾上腺素能神经元分化的有效调节物[13]。在中枢神经系统发育中,

骨形成蛋白2 在室管膜区表面有表达, 可以启动VZ 内的新皮层前体神经细胞向神经元分化。体外培养的神经上皮细胞在骨形成蛋白 2 作用24 h 之后, 可以增加分化产物中神经元数目, 提示骨形成蛋白

2 能够促进神经干细胞向神经元分化。

三、神经营养因子、脑源性生长因子

神经营养因子刺激鸟类神经管前体细胞分化为运动神经元, 但对分化的离体运动神经元的存活总数则无明显影响。但是神经营养因子对细胞分化的影响似乎是通过促进已分化的神经细胞的成熟, 而不是使未分化的多能干细胞向神经元分化。脑源性生长因子、胰岛素样生长因子、血小板源性生长因子等被证实增加神经干细胞向神经元表型方向的分化。睫状神经营养因子和白血病抑制因子作用于多潜能神经干细胞, 诱导它们分化成星形胶质细胞;而甲状腺素T3 则促使其分化为少突胶质细胞[14]。Kim 等[15]研究表明, 粒- 巨噬细胞集落刺激因子可促进神经祖细胞增殖, 抑制其分化及凋亡。另外, 参与神经干细胞诱导分化的细胞因子有细胞因子白细胞介素类, 如白介素1α具有诱导人神经干细胞向多巴胺神经元分化的作用, 联合应用白介素1α、白介素11、白血病抑制因子和胶质细胞源性神经营养因子对人神经干细胞向成熟的多巴胺神经元分化具有协同作用[16]。

四、化学诱导剂及药物

化学诱导剂被引进神经干细胞体外诱导实验中并被证实有效, 邓红等[17]分离培养新生大鼠纹状体脊髓神经干细胞, 观察不同浓度