第三节 动物的克隆(自己用)

1.运用已学知识，设想怎样获得单一类型的抗体？ 2.能否用单个B淋巴细胞通过克隆形成的细胞群来 产生单一类型的抗体呢？
单克隆 抗 体
-化学性质单一、特异性强的抗体。
设计方案： 一个B淋巴细胞－－只分泌一种特异性抗体 小鼠骨髓瘤细胞－－能无限增殖
杂种细胞
• 尔斯坦(阿根廷)和科勒(德国)因此在1984年获诺 贝尔奖。
（3）制备过程为何要经过两次筛选？
第一次筛选获得多种杂交瘤细胞 第二次筛选出特异抗体的杂交瘤细胞。
（4）制备过程中应用哪些细胞工程技术手段？
细胞融合技术、细胞培养技术。
(5) 本过程利用了哪些原理？
免疫原理、细胞融合原理、动物细胞培养原理
四、动物的克隆繁殖
★理论上，分化的动物细胞能像植物细 胞一样脱分化、再分化成一个动物体吗？
三、动物的细胞融合技术及其应用
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什么是细胞融合技术？ 为什么要进行细胞融合？ 如何实现细胞融合？
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1、动物细胞融合
定义 指用自然或人工方法, 使两个或多个不同的细 胞融合成一个细胞的过 程。 不同基因型的细胞之间 的融合就是细胞杂交。
两个细胞正在融合
受精作用
诱导融合的因素
• 生物法：灭活的仙台病毒诱导融合
单抗的制备过程
1.用外界抗原刺激动物（如
小鼠，兔子等），使其产生
1.体外培养：通过动物 生抗体； 细胞培养技术获得大量 2.利用仙台病毒或聚乙二醇 的杂交瘤细胞，从细胞 等作为介导，使经免疫的动 培养液中获得的单克隆 物的脾细胞与可以无限传代 抗体； 的骨髓瘤细胞融合； 2.体内培养：将杂交瘤 （3）经过筛选、克隆培养， 细胞注射到小鼠的腹腔 获得来自单一细胞的既能产 中增殖，最后从小鼠的 生特异抗体、又能无限增值 腹水中提取、纯化单克 的杂交瘤细胞克隆 隆抗体。
4、为什么要分装？
培养的细胞会因细胞密度过大和代谢消耗引起营养枯竭，不能正常生长。
5、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成 新个体？
不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体
一、动物细胞培养
首先，将动物体内的一部分组织取出，经 过机械消化或胰酶消化，使其分散成单个细 胞；
利用灭活仙台病毒是动物细胞融合 所特有的。 这是由于病毒的磷脂外衣与动物细 胞的膜十分相似的缘故。病毒外壳上 的某些糖蛋白可能还有促进细胞融合 的功能。 • 化学法：聚乙二醇诱导融合 因为聚乙二醇易得、简便，且融合 效果稳定，是目前应用最广泛的方法。 • 物理法：电刺激诱导融合
病毒颗粒黏 附细胞表面
一般是指从开始到传至10代细胞的培养
细胞系、细胞株
细胞株：通过一定的选择或纯化方法，从原代培 养物或细胞系中获得的具有特殊性质的细胞，称 为细胞株。 特点：一般具有恒定的染色体组型、同功酶类型、 病毒敏感性和生化特性等。 连续细胞株：可以连续多次传代的 有限细胞株：可传代次数有限 细胞系：泛指可以传代的细胞； 细胞株: 具有特殊性质的细胞系
思考题
11、动物细胞培养瓶内表面为何要光滑、无毒？ 易于培养细胞贴壁，进行生长增殖 12、培养瓶中的细胞培养到什么时候就不再分裂、增殖？ 当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞分裂 就会停止分裂增殖，这种现象叫接触抑制。 13、如此时细胞数量并未达到人们的需求，应该怎样办？ 将贴满细胞壁的细胞用胰蛋白酶处理，然后继续增殖。
细胞膜被 病毒颗粒穿通
细胞膜连接
细胞融合、形成杂种细胞
5、应用
此技术有什么缺点和优点？
1.由于细胞杂交中染色体容易丢失，因此利 用杂交细胞检测特定染色体丢失与特定基因 产物减少的对应关系，可以进行基因定位。 2.克服远缘杂交不亲和的障碍
鼠—鸡、鼠—兔、鼠—猴、人—鼠、人—兔、
人—鸡、人—蛙、酵母菌—鸡 、人—胡萝卜等
细胞株、细胞系
获得细胞或 细胞产物
思考几个问题
• 1、在大多数细胞培养中都不直接使用人的皮肤作为材料 而是选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织,为什么？
因为这些组织或器官上的细胞生命力旺盛，分裂能力强
2、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？
成块组织不利培养，分散了做成细胞悬浮液利于培养
3、胰蛋白酶的作用？胃蛋白酶可以吗？
免疫反应，使B淋巴细胞产
思 考：
（1）为什么用小鼠骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合？
细胞的同源性越近，融合形成的杂种细胞越易成活。继承了双亲细胞的遗 传物质，不仅具有B细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可 以获得大量单克隆抗体。
（2）骨髓瘤细胞是癌细胞吗？
有无限增殖能力的细胞是肿瘤细胞，而具有转移能力的肿瘤细胞，称 为癌细胞，所以瘤细胞不能等同于癌细胞。
思考题
６、细胞膜的主要成份是什么？
７、胰蛋白酶能将细胞消化掉吗？ 蛋白质和磷脂 能 ８、既然胰蛋白酶能将细胞消化掉，那将动物组织分散 成单个细胞要注意什么问题呢？ 注意时间的控制 ９、能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么？ 不能，因为两的最适PH不同，而正常组织细胞的生存环 境与胰蛋白酶的最适PH较接近 １０、动物细胞培养取材时，一般是取胚胎组织或幼 龄动物的组织或器官，请解释原因？ 胚胎组织或幼龄动物的组织或器官分裂、增殖旺盛
体细胞克隆成功的意义：
1、证明了高度分化的细胞也可以回复到类似受 精卵时期的功能。 2、证明了细胞质具有调控细胞核发育的作用。
克百度文库成功的条件（必备的基础）P20
•1、具有包含物种完整基因组的细胞核的活细胞。(如乳腺上皮 细胞) •2、能有效调控细胞核发育的细胞质物质。（如去核的卵的细 胞质） •3、完成胚胎发育的必要的环境条件。（如诱导核-质重组细胞 生长、分化的实验条件和怀胎母体的子宫环境）
小资料
1、二倍体细胞通常为有限细胞系 2、连续细胞系被认为是发生转化了的细胞系， 大部分具有异倍体核型。
有的连续细胞系是恶性细胞系，具有致癌性； 有的连续细胞系获得了不死性，但保留接触抑制现象，不致 癌。
有限细胞系 （二倍体） 连续细胞系
细胞系
恶性细胞系-异体致瘤
（异倍体核型） 不死性-不致癌
二、动物组织培养
4、克隆的难易程度: •单细胞不如群体细胞 •原代细胞、有限细胞系＜连续细胞系、转化或肿瘤细胞 5、提高克隆形成率的措施：选择适宜的培养基、添加血清（胎牛 血清）、滋养细胞（如经射线照射本身是去增值力的小鼠成纤维 细胞）、激素（胰岛素等）刺激、 CO2培养箱、调节PH值等 6、用途：如从普通细胞系中分离出缺乏特殊基因的突变细胞系。
在培养的过程中，细胞会结构和功能的变化
接触抑制
细胞在贴壁生长 过程中,随着细胞分 裂,数量不断增加,最 后形成一个单层,此 时细胞间相互接触, 细胞分裂和生长停止。
有关概念
传代培养：将原代细胞分成若干份，接种到 其他培养基中，使其继续生长繁殖。 传代培养一般指10-50代细胞的培养
原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为 原代细胞。
资料：培养细胞的生存环境
1.无菌、无毒环境：添加一定量的抗生素， 定期更换培养液 模拟人和哺乳动物细 胞在体内的最适环境 2.适宜的温度和PH：3537℃;PH:7.2-7.4 3.气体环境（CO2培养箱）：95%O2＋5%CO2 4.特殊的培养液：主要有：葡萄糖、氨基酸、 无机盐、维生素和动物血清等
(三)细胞核移植实验和动物的克隆繁殖
1、过程：利用一个细胞的细胞和来取代另 一细胞中的细胞核，形成一个重建的“合子”
体细胞 核移植
胚胎细胞 核移植
胚胎细胞核的移植成功率远高于成体细胞
哺乳动物-核移植实验
第一步，将小鼠囊胚内细胞团的细胞核一直 到去核的受精卵中，将重组细胞培养到发 育为囊胚； 第二步，将此早期胚胎植入同步孕鼠子宫中。
应用：
为遗传疾病的治疗、优良品种的培育等提供了重要途 径；对濒危动物的保存也有重要意义。
思考题
1、植物组织培养过程将组织分散成单个细胞的吗？ 没有 ２、动物细胞培养过程将组织分散成单个细胞的吗？是 ３、为何动物细胞培养过程将组织分散成单个细胞的呢？ 成块的组织细胞靠在一起,彼此限制了细胞的生长和增殖 ４、如何将动物组织分散成单个的细胞呢？ 先用剪刀剪碎,后用蛋白酶处理 ５、胰蛋白酶的作用是什么呢？由此可说明细胞间的物质 是什么成份？ 胰蛋白酶水解蛋白质 细胞间的成份是蛋白质
动物组织培养：动物组织在体外及人工条 件下维持生活状态或生长特性。
注意点： 1.动物组织培养过程中可以伴随组织分化 2.由于细胞运动，组织成分会发生结构与功能的 变异，最终还是成了简单的细胞培养。
三、动物器官培养
器官的原基、器官的一部分或整个器官在 体外和人工控制的条件下得以保存生长，在此 过程中保持器官的结构、功能及分化能力
★动物细胞实际上表现出全能性的情况 如何呢？
四、动物的克隆繁殖
（一）动物细胞全能性的表现程度
（1）高等动物细胞 受精卵 > 胚胎干细胞 > 多能干细胞 > 单能干细胞 > 体细胞
如多能造血干细胞： 可分化为红细胞、 白细胞、血小板等
（2）低等动物细胞：全能性一般容易体现。如水螅的上皮细 胞，不经过分裂就可以转变为上皮、肌肉细胞。
（二）动物难以克隆的根本原因
在动物的个体发育过程中，分化的结果使得细胞 在形态和功能上高度特化，这是由于细胞在伴随着它 们发育过程中在时间、空间的变化，基因表达的调控 使得细胞中合成了专一的蛋白质。
• 动物的基因组中，一类基因是维持生存的，在各种细胞中 都处于活动的状态。另一类基因随着组织器官和发育阶段 不同而选择性表达。 • 分化的细胞内基因的活动很不完全，因此很难像受精卵那 样发挥细胞全能性。
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如何获得纯系的细胞系？ （克隆培养法）
把一个细胞从群体中分离出来培养
二、克隆培养法
1、克隆培养法概念：把一个细胞从群体中分离出来培养，使之繁 殖成一个新的细胞群体的技术。（克隆培养与群体培养是一个等 位概念） 2、特征：纯系（遗传性状均一、表现性状相似） 3、基本要求：必须保证分离出来的细胞是一个而不是多个。
绵羊“多莉”克隆过程：
克隆羊成功的分子细胞生物学机理：
供体核DNA中有来源于乳腺细胞细胞质的调节 蛋白，它阻止了核基因的表达。 重组卵细胞，基因的转录没开始，无调节蛋白 重组移核细胞丢失了源于乳腺细胞的调节蛋白。 经过三次分裂后，原乳腺细胞的调节蛋白便全部被 卵细胞质中的蛋白因子替换了， 因此核DNA被重新编排，细胞开始表达自己的 基因。
动物细胞与组织培养 动物 的克 隆常 用技 术 克隆培养法 动物细胞融合 单克隆抗体 细胞核移植
动物克隆的技术基础是动物细胞与组织培养 细胞工程的主要手段是细胞培养和细胞融合
皮肤移植显生机
动物细胞、组织的培养
当一个人烧伤需要皮肤移植的时候,最好 移植谁的?
• • • • • 1、其他人 2、父母 3、一般兄弟或姐妹 4、同卵双胞胎兄弟或姐妹 5、自己
动物细胞的培养和克隆形成
1、广义的动物组织培养(组培)包括：
细胞培养、组织培养和器官培养。
2、动物组织培养技术的发展：
自然培养基
1885年，鸡神经板在生理盐水中培养成活。 1903年，皮肤及白细胞培养于腹水及血清中， 存活1个月。 1907年，美，蛙胚神经管培养在蛙淋巴液中， 观察到细胞的阿米巴运动，创立了悬浮培养法。 1951，建成海拉细胞系，进入全新阶段
然后，在人工控制的培养条件下，使这些 细胞得以生存，并保持生长、分裂乃致接触 抑制和有规律的衰老、死亡性能等生命活动 现象。 注意：细胞之间在生命活动中相互依存， 所以也像体内一样呈现一定的组织特性。
细胞贴壁：
细胞培养时，悬液中分散的细胞很快就贴 细胞贴壁 附在瓶壁上，称为细胞贴壁。 要求：培养瓶或培养皿的内表面光滑、无 毒、易于贴附。
含激素，保证细 胞顺利生长增殖
思考：较植物组培培养基有何独特之处？ 1.液体培养基；2.葡萄糖.3、动物血清
植物细胞和动物细胞培养的比较
比较项目 植物组织培养 动物细胞培养
原理
培养基性质
细胞的全能性
细胞增殖
固体培养基
液体培养基
葡萄糖、动 物血清
培养基特有成分 蔗糖、植物激素
培养结果
培养目的
植物体 培育新植株等
3.利用杂交瘤技术，制备单克隆抗体。
读下面一段文字资料，思考以下问题： 长期以来，为了获得抗体，采用的是把某种抗原 反复注射到动物体内，然后从动物血清中分离出所需 抗体的方法。用这种方法获得的抗体，不仅产量低， 而且抗体的特异性差，纯度低，反应不够灵敏。人们 发现，在动物发生免疫反应的过程中，体内的 B细胞 可以产生多达百万种以上的特异性抗体，但是每个B 细胞只分泌一种化学性质单一、特异性强的抗体。要 想获得大量的单一抗体，必须用单个B细胞进行无性 繁殖，即克隆。