第二章基因工程制药
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第二章 基因工程制药
第二章基因工程制药
第二章 基因工程制药
第一节 第二节 第三节 第四节 第五节 第六节 第七节 第八节 第九节
概述 目的基因的获得 基因表达 基因工程菌的不稳定性 基因工程菌中试 重组工程菌的培养 基因工程药物的分离纯化 变性蛋白的复性 基因工程药物的质量控制
第二章基因工程制药
第一节 概 述
第二章基因工程制药
二、大肠杆菌中的基因表达
PBG-2: 由PBV220衍生,可以表达与
IgG结合的融合蛋白，并且是有蛋 白剪切位点，便于表达后纯化及 纯化后剪切。
第二章基因工程制药
二、大肠杆菌中的基因表达
（2）PET系统 ① IPTG诱导（异丙基-硫代-D-半乳糖苷） ②多克隆位点上有NdeI或NCOI单一切点，切开后粘性末端为
第二章基因工程制药
二、基因工程药物生产的基本过程
1. 目的基因的获得 2. 构建DNA重组体 上游技术 3. 构建工程菌 4. 工程菌的发酵 5. 外源基因表达产物的分离纯化 6.产品的检验
第二章基因工程制药
第二章基因工程制药
三、国内外基因工程药物研究进展
目前研制的基因工程药物主要包括: 1. 免疫性蛋白，如各种抗原和单克隆抗体; 2. 细胞因子，如各种干扰素、白细胞介素、集落刺激生长因子
第二章基因工程制药
一、宿主菌的选择
1. 原核细胞（大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌等） 2. 真核细胞（酵母、丝状真菌、动物细胞等）
第二章基因工程制药
一、宿主菌的选择
1．原核细胞 （1）大肠杆菌
优点：遗传背景清晰，生长迅速。 缺点：①胞内表达，提取困难。
②包含体形式，需复性。 ③表达后不存在修饰作用，应用受限。 ④翻译产物的N末端常多余一个甲硫氨酸残基（AUG启始密码子
（1）选择表达目的蛋白质丰度高的 mRNA的生物材料。
（2）分离总RNA。 （3）分离mRNA（多聚T纤维素）
第二章基因工程制药
一、反转录法
2．cDNA第一链的合成（RT-PCR，随机引物）
3．cDNA第二链的合成 发 RN夹 as结 eH构S1核酸
4．cDNA克隆
质粒 入噬菌体
酶、定向 、AT克隆
ATG，便于外源基因插入表达。 ③在外源基因的N末端可融合6个His，便于纯化。
第二章基因工程制药
二、大肠杆菌中的基因表达
2．影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素 （1）外源基因的拷贝数 （2）启动子的强弱 （3）SD序列的有效性 （4）SD与ATG的间距 （5）密码子的组成（偏爱性） （6）产物的稳定性 （7）产物对宿主的影响
一、基因工程技术生产药品的优点 二、基因工程药物生产的基本过程 三、国内外基因工程药物研究进展
第二章基因工程制药
第一节 概 述
基因工程技术诞生：20世纪70年代 现代生物技术的发展 基因工程：
应用DNA重组技术，按照人们的意愿，在基因水平上改变生物 遗传性，创造新的生物物种，通过工程化手段为人类提供有用产品 和服 务的技术。
1．小分子量的蛋白或多肽 2．已知核苷酸顺序或氨基酸顺序 3．费用较高
第二章基因工程制药
V第it三a节m基in因表B达2
基因表达的成败，直接影响药品的质量、成本。基因表达是外 源基因在生物体转录、翻译以及所有加工过程，是外源基因异源转录 翻译利用宿主功能的过程，也是外源DNA、RNA、Pr克服宿主细胞 进攻，保护自身的过程。
第二章基因工程制药
二、大肠杆菌中的基因表达
3．表达形式 （1）融合蛋白，增强稳定性。 （2）非融合表达。
第二章基因工程制药
三、酵母中的基因表达
1．载体 ①YEP类（酵母附加体质粒） 由大肠杆菌质粒，2μm质粒和Trp或URA3组成， ARS来自2μm质粒。 ②YRP（酵母复制型质粒） ARS来自染色体DNA、TrP1、URA3双标及大肠杆菌质粒。 ③YCP（酵母着丝粒型质粒） 除具有YRP元件外，还具有着粒成份。
第二章基因工程制药
二、大肠杆菌中的基因表达
基因工程药物研究中常用的表达载体 （1）PBV220系统
① PL、PR串联启动子，增强启动信号。 ② rrnB基因的终止信号。 ③ PL、PR与rrnB之间有MCS及SD序列。 ④ CITS857抑制子基因（温控诱导） ⑤质粒较小（366kb），便于插入大的外源基因
编码）容易引起免疫反应。 ⑤大肠杆菌产生内毒素给纯化带来不便。 ⑥蛋白酶水解作用破坏产物。
第二章基因工程制药
一、宿主菌的选择
1．原核细胞
（2）枯草芽孢杆菌
优点：分泌能力强，产物可直接到培养液中。 缺点：蛋白酶水解活性更强。
（3）链霉菌
优点：①不致病 ②分泌能力强 ③具有糖基化能力
缺点：培养条件要求高、遗传稳定性差
化学法
5．将重组体导入宿主细胞
电击
转染
第二章基因工程制药
一、反转录法
6．cDNA文库的鉴定
核酸探针
寡核苷酸探针
差示
抗体
抗性获得
Hale Waihona Puke Baidu
显色
抗性失活
第二章基因工程制药
一、反转录法
7．目的cDNA克隆的分离和鉴定
酶切 、 测序
阅读
计算机辅助分析
第二章基因工程制药
二、化学合成法
优点：准确性高、人工接头、改进、利用 局限性：
第二章基因工程制药
一、基因工程技术生产药品的优点
1. 大量生产过去通过常规生化分离提取技术难以获得（富集）的 生理活性蛋白和多肽。
2. 提供足够数量的生理活性物质。 3. 开发更多的内源性生理活性物质。 4. 通过基因工程和蛋白质工程对天然生理活性物质进行改造，优
化天然的生理活性物质。 5. 利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。 6. 降低成本，提高产品质量。
第二章基因工程制药
一、宿主菌的选择
2．真核细胞
（1）酵母：无毒、倍增时间短、分泌功能、糖基化作用、使之 成为理想的宿主。
（2）丝状真菌：肽剪切、糖基化。 （3）哺乳动物细胞：产品保真性高，生产效率低。
第二章基因工程制药
二、大肠杆菌中的基因表达
1．载体 表达载体必须具备下列条件： ①载体能独立复制 ②具有多克隆（MCS）位点和标记基因 ③具有很强的启动子 ④具有调节基因 ⑤具有很强的终止子 ⑥具有产生带有SD序列和AUG的mRNA的能力
表皮生长因子、凝血因子； 3. 激素，如胰岛素、生长激素、心钠素； 4. 酶类，如尿激酶、链激酶、葡激酶、组织型纤维蛋白溶酶激
活剂、超氧化物歧化酶等。
第二章基因工程制药
Vitamin A
第二章基因工程制药
第二节 目的基因的获得
一、 反转录法 二、化学合成法
第二章基因工程制药
一、反转录法
1．mRNA的纯化
第二章基因工程制药
第二章 基因工程制药
第一节 第二节 第三节 第四节 第五节 第六节 第七节 第八节 第九节
概述 目的基因的获得 基因表达 基因工程菌的不稳定性 基因工程菌中试 重组工程菌的培养 基因工程药物的分离纯化 变性蛋白的复性 基因工程药物的质量控制
第二章基因工程制药
第一节 概 述
第二章基因工程制药
二、大肠杆菌中的基因表达
PBG-2: 由PBV220衍生,可以表达与
IgG结合的融合蛋白，并且是有蛋 白剪切位点，便于表达后纯化及 纯化后剪切。
第二章基因工程制药
二、大肠杆菌中的基因表达
（2）PET系统 ① IPTG诱导（异丙基-硫代-D-半乳糖苷） ②多克隆位点上有NdeI或NCOI单一切点，切开后粘性末端为
第二章基因工程制药
二、基因工程药物生产的基本过程
1. 目的基因的获得 2. 构建DNA重组体 上游技术 3. 构建工程菌 4. 工程菌的发酵 5. 外源基因表达产物的分离纯化 6.产品的检验
第二章基因工程制药
第二章基因工程制药
三、国内外基因工程药物研究进展
目前研制的基因工程药物主要包括: 1. 免疫性蛋白，如各种抗原和单克隆抗体; 2. 细胞因子，如各种干扰素、白细胞介素、集落刺激生长因子
第二章基因工程制药
一、宿主菌的选择
1. 原核细胞（大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌等） 2. 真核细胞（酵母、丝状真菌、动物细胞等）
第二章基因工程制药
一、宿主菌的选择
1．原核细胞 （1）大肠杆菌
优点：遗传背景清晰，生长迅速。 缺点：①胞内表达，提取困难。
②包含体形式，需复性。 ③表达后不存在修饰作用，应用受限。 ④翻译产物的N末端常多余一个甲硫氨酸残基（AUG启始密码子
（1）选择表达目的蛋白质丰度高的 mRNA的生物材料。
（2）分离总RNA。 （3）分离mRNA（多聚T纤维素）
第二章基因工程制药
一、反转录法
2．cDNA第一链的合成（RT-PCR，随机引物）
3．cDNA第二链的合成 发 RN夹 as结 eH构S1核酸
4．cDNA克隆
质粒 入噬菌体
酶、定向 、AT克隆
ATG，便于外源基因插入表达。 ③在外源基因的N末端可融合6个His，便于纯化。
第二章基因工程制药
二、大肠杆菌中的基因表达
2．影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素 （1）外源基因的拷贝数 （2）启动子的强弱 （3）SD序列的有效性 （4）SD与ATG的间距 （5）密码子的组成（偏爱性） （6）产物的稳定性 （7）产物对宿主的影响
一、基因工程技术生产药品的优点 二、基因工程药物生产的基本过程 三、国内外基因工程药物研究进展
第二章基因工程制药
第一节 概 述
基因工程技术诞生：20世纪70年代 现代生物技术的发展 基因工程：
应用DNA重组技术，按照人们的意愿，在基因水平上改变生物 遗传性，创造新的生物物种，通过工程化手段为人类提供有用产品 和服 务的技术。
1．小分子量的蛋白或多肽 2．已知核苷酸顺序或氨基酸顺序 3．费用较高
第二章基因工程制药
V第it三a节m基in因表B达2
基因表达的成败，直接影响药品的质量、成本。基因表达是外 源基因在生物体转录、翻译以及所有加工过程，是外源基因异源转录 翻译利用宿主功能的过程，也是外源DNA、RNA、Pr克服宿主细胞 进攻，保护自身的过程。
第二章基因工程制药
二、大肠杆菌中的基因表达
3．表达形式 （1）融合蛋白，增强稳定性。 （2）非融合表达。
第二章基因工程制药
三、酵母中的基因表达
1．载体 ①YEP类（酵母附加体质粒） 由大肠杆菌质粒，2μm质粒和Trp或URA3组成， ARS来自2μm质粒。 ②YRP（酵母复制型质粒） ARS来自染色体DNA、TrP1、URA3双标及大肠杆菌质粒。 ③YCP（酵母着丝粒型质粒） 除具有YRP元件外，还具有着粒成份。
第二章基因工程制药
二、大肠杆菌中的基因表达
基因工程药物研究中常用的表达载体 （1）PBV220系统
① PL、PR串联启动子，增强启动信号。 ② rrnB基因的终止信号。 ③ PL、PR与rrnB之间有MCS及SD序列。 ④ CITS857抑制子基因（温控诱导） ⑤质粒较小（366kb），便于插入大的外源基因
编码）容易引起免疫反应。 ⑤大肠杆菌产生内毒素给纯化带来不便。 ⑥蛋白酶水解作用破坏产物。
第二章基因工程制药
一、宿主菌的选择
1．原核细胞
（2）枯草芽孢杆菌
优点：分泌能力强，产物可直接到培养液中。 缺点：蛋白酶水解活性更强。
（3）链霉菌
优点：①不致病 ②分泌能力强 ③具有糖基化能力
缺点：培养条件要求高、遗传稳定性差
化学法
5．将重组体导入宿主细胞
电击
转染
第二章基因工程制药
一、反转录法
6．cDNA文库的鉴定
核酸探针
寡核苷酸探针
差示
抗体
抗性获得
Hale Waihona Puke Baidu
显色
抗性失活
第二章基因工程制药
一、反转录法
7．目的cDNA克隆的分离和鉴定
酶切 、 测序
阅读
计算机辅助分析
第二章基因工程制药
二、化学合成法
优点：准确性高、人工接头、改进、利用 局限性：
第二章基因工程制药
一、基因工程技术生产药品的优点
1. 大量生产过去通过常规生化分离提取技术难以获得（富集）的 生理活性蛋白和多肽。
2. 提供足够数量的生理活性物质。 3. 开发更多的内源性生理活性物质。 4. 通过基因工程和蛋白质工程对天然生理活性物质进行改造，优
化天然的生理活性物质。 5. 利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。 6. 降低成本，提高产品质量。
第二章基因工程制药
一、宿主菌的选择
2．真核细胞
（1）酵母：无毒、倍增时间短、分泌功能、糖基化作用、使之 成为理想的宿主。
（2）丝状真菌：肽剪切、糖基化。 （3）哺乳动物细胞：产品保真性高，生产效率低。
第二章基因工程制药
二、大肠杆菌中的基因表达
1．载体 表达载体必须具备下列条件： ①载体能独立复制 ②具有多克隆（MCS）位点和标记基因 ③具有很强的启动子 ④具有调节基因 ⑤具有很强的终止子 ⑥具有产生带有SD序列和AUG的mRNA的能力
表皮生长因子、凝血因子； 3. 激素，如胰岛素、生长激素、心钠素； 4. 酶类，如尿激酶、链激酶、葡激酶、组织型纤维蛋白溶酶激
活剂、超氧化物歧化酶等。
第二章基因工程制药
Vitamin A
第二章基因工程制药
第二节 目的基因的获得
一、 反转录法 二、化学合成法
第二章基因工程制药
一、反转录法
1．mRNA的纯化