分离心肌细胞
急性分离大鼠心肌细胞：
1，准备工作：
a，器械：恒温水浴锅，langendorff装置，氧气，剪刀，止血钳，平镊，弯镊，眼科剪，平皿2个，500ml烧杯2个，100ml量筒1个，100ml注射器1个，1ml注射器2个，试管5-7个，吸管2个
b，液体：母液，NaOH(3mol/L),CaCl2(0.9mol/L),葡萄糖（细胞营养），II型胶原酶，BSA（胎牛血清蛋白，心肌细胞保护作用使其不至被酶损害），KB液（细胞保存液）。
2，步骤：
a，打开水浴锅，调节温度到37-37.5℃，提前拿出-20℃的KB液放在水浴锅中融化。
b，洗涤所有玻璃器皿，并用去离子水冲洗。
c，用去离子水从上倒入冲洗langendorff装置，用注射器从装置下端打入弯管中冲洗3遍。
最后用少量去离子水液封装置，避免灰尘进入。
d，配制无钙液：60ml台氏母液＋540ml去离子水＋葡萄糖1.2g（100ml/0.2g），充氧30-50min （一般可充40min），用NaOH调节PH至7.35-7.40。
e，配制有钙液：每100ml台氏液加0.2ml CaCl2，混合均匀。一般取300ml无钙液。
f，酶液配制：10mg II型胶原酶＋10mgBSA＋50ml无钙液溶解（酶液在取挂心脏结束后，再配制，避免酶液降解；先称取的酶应放于抽屉中避光保存。）
g，将有钙液用注射器从langendorff装置下端打入弯管中至上端脖颈处，注意不要有气泡，并将无钙液从装置上端倒入，打开氧气，将氧气针头插入langendorff管内。（PS：如果出现气泡反复挤压灌流装置下端胶管，将气泡挤到弯管上端）
h，将针头安装在langendorff装置最下端，注意不要有气泡。（PS：可将三通装置的灌流方向堵住，轻推注射器使有钙液流出，用液体流的冲击力冲破针头安装处的表面张力，消除气泡。）
i，取成年大鼠一只，雌雄不限，给一定剂量的麻药（依据体重）将大鼠麻倒。(或断髓) j，打开恒温水浴锅外循环，维持灌流液温度。
k，取心脏，挂心脏(取时速度要快，避免心腔淤血，影响灌流)
（１）用止血钳夹住剑突下皮肤，剪刀垂直向下剪，待剪开皮肤后，水平向两侧剪，注意不要剪开胸膜。
（２）用止血钳夹住剑突，剪开膈，从顶部剪，暴露心脏，撕开心包膜，用弯镊将肺向下拉，带动心脏向下，注意镊子不要碰触心脏，用眼科剪将主动脉剪断，用左手轻拖住心脏，将心脏取下。
（３）将心脏放入预先4℃保存的有钙液中，并置于冰上修剪心脏，有血液泵出，或肺动脉圆锥附近，即为主动脉，用镊子和剪刀将主动脉的边缘修剪平整。（PS：在修剪心脏时维持低温环境是减轻心脏跳动力，影响修剪。修剪时，不要将心脏提出液体外，避免空气进入，影响灌流。可将主动脉口用直镊夹住，然后用直剪进行修剪。）（４）将langendorff装置打开一半，注意液体流速不要太快，成股即可，用平镊和弯镊将主动脉夹住（PS：不要将主动脉夹伤），顺着液体流提升并悬挂于langendorff装置下端针头处，不要太深，最后用平镊夹住主动脉，在贴近平镊下方用线系紧主动脉。l，完全放开langendorff装置阀门，让液体以恒速流入心脏，由于流速较快，注意管上方要保持有液体，否则有大量气泡进入弯管，造成分离失败。
m，一直用无钙液冲洗心脏，至心脏颜色变浅，冠脉突出，心脏停止跳动。（PS：右心房是最后停跳的。）
n，用酶液进行消化，待心脏停止跳动5-8min加入酶。（PS ：有争议，通常实验时心脏一停跳，就加入酶消化。但过多的钙存在时，应用胶原酶或蛋白酶会引起心肌细胞膜破裂。）o，用50ml烧杯，接取前20ml流下的液体弃去，自此后接取的消化液要循环利用，消化开始，开始计时，计滴速。
p，消化过程，滴速由快变慢，由慢迅速变成滴下的液体有拉丝，心脏表面变粘（胶原等物质在消化液中存在），消化20-25min（仅做参考，冬夏季消化时间有差异），至表面韧性变低即可。
t，KB液充氧后，微调PH至7.20，将KB液装入标好的离心管中，分别剪右室，室间隔，左室，剪碎组织，放入离心管中吹打，弃去组织。
r，将细胞悬液放入4℃冰箱中稍静置1h。
PS：消化判断终点时，可先终止灌流，剪下右室下方组织，吹散在显微镜下观察细胞活性，决定灌流是否继续。或者可先将灌流装置终止，用手慢慢轻压心脏，避免伤害心脏，将心腔中消化液挤出，观察心脏形变不恢复即可。消化不要过。
有钙液和细胞悬液必须放于4℃贮存待用（尤其在夏季），否则会造成细菌污染，影响实验。
Tips：有钙液灌流—让心脏跳动，心腔中的血泵出；灌流时不至于淤血堵塞血管，影响灌流。
无钙液灌流—将心腔中的有钙液冲洗出，使心脏停止跳动；加入的无钙液不能过多，否则细胞不耐钙，分离出的细胞抖。
酶消化液灌流—消化连接心肌细胞的胶原等结缔组织，使心肌细胞分离。
灌流液应始终维持氧饱和，不使心肌细胞缺氧。
通常分离大鼠心肌细胞采用胶原酶，而分离豚鼠心肌细胞采用蛋白酶。
用无钙液冲洗时，使心脏组织疏松，灌流滴数加快，若滴数无明显变化为灌流不完全。
可用平镊夹持系线处水平旋转心脏，使灌流充分。
膜片钳使用流程
１，打开总稳压电源
２，打开不间断电源，数模转换器电源
３，打开显微镜开关
４，实验准备
５，打开电脑，放大器，进行试验
６，实验结束后，先关闭放大器
７，关闭电脑—显微镜—清理试验台
８，检查三维液压是否归零，检查显微镜，检查粗调是否归中，检查氮气是否关闭
９，清理实验室，并闭室内电源，水闸
打开电脑→将桌面上clampex软件打开→File→set Date File Index→向上→D盘→ftm→date →点新建文件图标→修改文件名，并将下面4个数字归零→保存关闭→clampex软件左上方图标（open protocol）→向上→D盘→ftm→protocol→#protocol#→zero pro→打开放大器→https://www.360docs.net/doc/fc13844629.html,MAND至on→记录电流调I及V-clamp→有钙液灌流，洗细胞，压好液接电位，形成电流回路→按Ω0钮（seal test）→上电极时应注意，不要将银丝碰弯，碰断；找电极，电极入液，显示电极阻值（1-3MΩ）若入液后，电极阻值达到KΩ，则说明电极尖断了，应将电极出水换电极→先粗调，后微调将电极针压上细胞，电极阻值上升大约0.5 MΩ说明电极已压上细胞→full scale→调转PIPETTE OFFSET钮，调基线，使电流归零→负压吸引并维持负压，阻值约20 MΩ时，调节钳制电位Holding -20，-40，-60mv基线平稳缓慢调节→使阻值上升至约100-120MΩ时，将负压放掉使阻值继续上升，电流下降，在维持基线平稳的基础上，为保证阻值上升，给予适当的负压→直至基线归零“平”并且阻值上GΩ，给予负压吸引“破”膜，并记录电流（记录中需维持负压，防止破开的膜关闭）→Edit保存至新建文件夹→记录结束后需记录最大膜电容。
打开放大器→https://www.360docs.net/doc/fc13844629.html,MAND至on→记录动作电位→调V及I-clamp NORMAL→记录。PS：同一细胞可记录多次，但如果每次重新破膜，需重新记录膜电容。
确定细胞是否破膜：①https://www.360docs.net/doc/fc13844629.html,MAND至OFF→调I RMS→电流值在3左右，即可确定破膜→重调至I，on→记录电流。
②观察电流夹角变得光滑，即可确定破膜。
确定破膜后，若基线未平，说明有漏电流，需补leak→调转leak钮，补充漏电流。重新记录电流和最大膜电容。
PS：放大器开关：power开，调I及V-clamp，再打开控制电钮；
关，先关控制电钮，track，V-track，再关power。
调节条件，在关闭控制电钮时才可进行。
放大器打开后至少1h方可关闭。
PS：开始试验前20min用有钙液贴槽子，恢复细胞耐钙，并使细胞贴壁，细胞不用过多；贴好槽子后，可用灌洗液（有钙液）灌洗细胞表面（速度要慢，避免贴壁细胞被吹起；灌洗装置为自制的注射器抽吸装置，每次替洗1/5浴液，清洗到视野清晰即可），使细胞表面光滑，有利于与微电极尖端形成高阻封接；使用显微镜前先将三维液压调到1左右，并在上下0.5的范围内使用；使用显微镜找电极，先粗调，用细胞找电极，然后用微调压住细胞，开始试验。
微电极的制备
1，采用两步拉制法，拉制电极（垂直拉制）
（１）设定两步拉制的温度step1:72℃；step2:51.9℃。
（２）将毛细玻璃管放在拉制仪上，打到step1的温度，拉出一个7-10mm的细杆
（３）再从细杆的中间偏下部位，用step2温度，将杆拉断，拉出两根玻璃电极
PS：拉制好第一步后，需等电极冷却后，拉制第二步，否则会使电极尖端变短变粗，电极阻值变大，影响实验。
2，充灌电极液
微电极在使用前要充灌电极液，用注射器将电极液充入玻璃微电极中，在充灌过程中，应尽
量避免电极内出现气泡，如出现了可将电极尖端向下，轻敲壁除去气泡。
PS：微电极应拉制的长短均匀，电极阻值相近，方便实验，一般拉制成功后，有1~3MΩ的电阻，常用于全细胞记录模式。避免碰触微电极尖端，灰尘进入堵住电极，影响试验。充灌电极液不应过多，大概1cm。充灌时首先将电极尖端浸入电极内液，利用毛细管虹吸作用使尖端部分充满液体，然后再从电极尾端充灌。在充灌中应避免电极内出现气泡，如有气泡可使电极尖端向下，轻敲管壁除去。也应避免充灌电极内液太多，否则电极内液溢出会使支持器表面变湿、形成薄膜而产生热噪声，影响实验噪声基线。
用仪器记录数据
在细胞进行封接以前，要用有钙液灌流复钙（约20min），使心肌恢复正常，才能记录心肌细胞中各种电位及动作电位。
PH剂较正操作步骤：
1，准备：（1）电极，仪表的BNC插头，连接温度传感器到HTC
（2）用变压器把仪表连接到电源
（3）按PH（mv）键，设置PH模式
2，较正：（1）按set up，显示“clear buffer”按Enter
（2）按set up，直至显示缓冲液组“1.68,4.01,6.86,9.18,12.46”或所需的其他缓冲液组，按Enter
（3）将电极清洗，擦干，浸入第一种4.01缓冲液中，等数值稳定，出现s时，按standarize，仪器自动校准，如时间较长，可按Enter手动校准，作为第一点校准，被储存显示“”。
（4）清洗电极，擦干，放入6.86缓冲液中，校准方法同上，但显示“”和**% “slape x good electrode”**显示测量的电极斜率，如在90-105%范围内可接受，如不，则证明与理论值有较大差异，应重新校正，显示“Err”。
（5）再清洗电极，擦干，放入9.18，再进行校正，一般为3点校正。
一些常用的液体成分：
，IK，Ito）母液(台母)
CaCl2 1.8 147.03
0.9mol/L每100ml无钙液中加0.2mlCaCl2（0.9mol/L：6.6g/50ml）
用NaOH调PH值（7.40，一般7.35以上即可）
NaOH配制：3.6gNaOH溶于30ml去离子水中
２，配制KB营养液（细胞保存液）
用KOH调节PH至7.35
用5mol/L KOH调节PH（28gKOH溶于100ml去离子水中）
PS:先直接加固体KOH调节至7.2左右，再加液体KOH。KB液溶解缓慢，在未完全溶解前加入固体KOH有助于KB液快速溶解。溶解后4℃静置一宿，分装于用去离子水冲洗过的50ml细胞培养瓶中，并与-20℃冻存。
３，电极液
用1mol/L KOH调PH至7.20。
PS：电极内液需经0.2μm的滤膜或滤纸过滤。电极液配置好后需分装于1.5ml EP管中，并-20℃冻存。实验前需先解化，实验过程中应始终置于冰袋上使用。
4，测IKr电流用液体：
电极内液：20ml
实验加：
CaCl2 2 147.03 1.47
Clucose 10 198.2 9.91
用tris-OH(3M为其浓度—0.899g+30ml—mM x 10-3V(L)=g )调节PH至7.4 终液：每1000ml需Glu 1.982g ；CaCl2 2.22ml 0.9M
原代心肌细胞培养技巧【转】
原代培养心肌细胞作为一种主要的研究模型，被广泛应用于心血管研究之中.我们实验室经过长期尝试，摸索出了一些行之有效的方法，并积累了一些经验，现总结如下： 1新生大鼠鼠龄的选择新 生大鼠心肌细胞在出生后3 d内具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞，不再具有分裂增殖能力.因此，大鼠出生时间越短，其心肌细胞分离后成活率越高，越容易贴壁生长.大量观测表明，选择1~3 d龄大鼠分离其心肌细胞进行原代培养较为理想.其中尤以半日龄大鼠心肌细胞培养效果最佳. 2消化酶的选择及使用 新生大鼠心肌细胞的分离可采用组织块法和消化法，前者因不易获得密度均一的细胞且难控制成纤维细胞的生长而较少采用.消化法中常使用的酶有3种：胰蛋白酶、胶原酶I或Ⅱ以及透明质酸酶.透明质酸酶多与胰蛋白酶或胶原酶联合应用.胰蛋白酶作用较强，容易造成心肌细胞损坏.胶原酶作用较缓和，能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤小，且在新生大鼠心肌组织，以胶原I为主,故我们选用胶原酶I.文献报道胶原酶的工作浓度一般在0.6~1 g?L1,我们使用的为0.8 g?L1.胶原酶最好现用现配. 3消化程度的把握 新生大鼠心肌细胞对酶消化极为敏感.消化过度可使肌原纤维出现萎缩，细胞死亡率增加或丧失贴壁能力及搏动能力；消化不足，细胞聚集成团，无法分清细胞边界，难以形态学观测.消化过程中使用磁力搅拌器时应注意1)转速一般控制在60~80 r?min1左右.(2)每次消化的时间须结合消化酶浓度确定.(3)将粘附在搅拌子上的心肌组织吹散，使酶液充分接触组织.(4)适宜温度为35~37℃.(5)当组织由红转白呈半透明状态时，应停止消化. 4接种的细胞密度 心肌细胞接种密度不仅影响细胞间的相互接触，进而影响细胞对肥大刺激的反应，而且影响长期培养细胞的成活率.接种细胞的绝对数量应经精确计算.一般而言，应根据实验的观测目的决定单位面积上的细胞数量.例如，如作形态学观测,六孔板中每孔的接种细胞数量应控制在1×105~2×105个；若需收获心肌细胞作mRNA或蛋白表达水平的观测，则每孔的接种密度可增加到5×105~6×105个. 5细胞的分散度与接种的均匀性 分离出的心肌细胞，在溶液中Ca2+作用下较容易出现集聚现象.因此，在进行差速贴壁前后，均应反复多次地轻柔吹打使心肌细胞成单个分散状态.接种后，应小心使心肌细胞均匀地分布于培养板上,避免细胞向培养孔的中央集聚.此外，可将培养板放入孵箱后用滴管轻轻吹打各孔中央部位2~3次，但应格外注意避免污染. 6对成纤维细胞的抑制与血清种类的选择 成纤维细胞较心肌细胞更容易贴壁且具有分裂增殖能力，经差速贴壁后仍有少量成纤维细胞混杂于心肌细胞之中，若处理不当，很容易生长成优势细胞.溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine, BrdU)可干扰细胞的有丝分裂，故常规使用BrdU抑制成纤维细胞的生长.但是，如果使用胎牛血清培养细胞，由于胎牛血清所含的促细胞有丝分裂的因子较多，BrdU 很难完全抑制成纤维细胞的生长.改用小牛血清则可克服这种现象的出现，获得高达90％以上的心肌细胞. 7换液时间 进行心肌细胞形态学观测时，接种密度较低，贴壁的心肌细胞数量减少，为避免成活心肌细胞随换液而被丢弃，应在接种48 h后换液.这样不仅使贴壁的心肌细胞数量明显增加，而且BrdU作用时间较长，对成纤维细胞的抑制作用更确实.此外，去血清后可用ITS和0.1 g ?L1BSA对心肌细胞进行营养支持，对心肌细胞贴壁率与凋亡率均不产生明显影响. 8抗污染措施
小鼠心脏离体灌注缺血-再灌注模型
小鼠心脏离体灌注缺血-再灌注模型 （2013/6/20 廖翔） 一．材料 1. 所需液体：K-H液（NaCl 118, NaHCO3 24, CaCl2 2.5, KCl 4.7, KH2PO4 1.2, MgSO4 1.2, Glucose 11, EDTA 0.5 （in mM））、低分子肝素溶液（500IU/ml）、戊巴比妥钠液、碳酸氢钠液、盐酸液。 2. 取鼠：标准C57小鼠（20-25g）。 3. 物品： ?手术剪、血管钳 1套，用于开腹、开胸 ?眼科剪、眼科镊 1套，用于开胸后取心、剔除心缘纤维组织 ?小圆培养皿 2个，培养皿内加4°K-H液，先后装取出的心 ?1000ml烧杯 2个 +小转子，一个用于配制H-K液，一个装双蒸水，清洗灌注仪器 ?500ml烧杯 1个，用作废液缸。 ?50ml烧杯 1个（用于少量的药物灌注） ?吸管 2个，分别滴加碳酸氢钠液、盐酸液 ?持针器1把，夹持带针7号线 ?尖镊2把，夹持主动脉 ?大镊子1把，持物 ?1mL注射器 2个，分别用于注射麻药、肝素 ?5mL注射器 1个，用于加CaCl2液 ?50mL注射器1个，用于加K-H液 ?5mL注射器针头自制灌注针 1个（用于挂小鼠心脏，尖端磨平，距针尖2mm出磨出刻痕以便打结固定） ?6号线（用于固定心脏）、带针7号线（用于结扎LCD） ?氧气罐（95% O2 +5% CO2） ?20X20cm泡沫板1个+大头针4枚，用于固定麻醉后的小鼠 ?泡沫盒1个，装冰块 ?橡皮泥，用于固定挂心脏的自制注射器 4. 仪器：手术显微镜、langendorff离体灌注装置（灌注系统、恒温装置、灌注泵） 5. 另外准备手套、口罩、棉签等 注：现在差的物品有：尖镊2把（夹持主动脉） 二．操作方法： 1、打开离体灌注装置，设备自检。注意灌注压调零；配制K-H液，调pH为7.4左右（7.35-7.43），加入灌注装置恒温至37°，运行灌注泵，排空灌注系统的气泡。加适量K-H液于小圆培养皿中放于冰块上（4°），打开显微镜，将需要使用的工具摆放到位。 2、小鼠称重后，腹腔注射戊巴比妥钠(65mg/kg)进行麻醉，予以普通肝素(300IU/kg)肝素化，待小鼠麻醉完全后，固定小鼠于泡沫板上。迅速开腹，迅速开胸，切断主动脉和上下腔静脉，取出心脏，立即放入4°K-H液中（此过程<15s），冲洗掉残留在主动脉内的血液，寻找升主动脉，镊子夹住升主动脉血管壁并固定于自制针头，插入灌注针至主动脉瓣上方，6号丝线结扎后，迅速移至灌注装置上，用K-H液灌注，整个灌注期间用医用氧气进行鼓泡式氧合。必要时可切开右心耳，使冠
大鼠原代心肌细胞提取方法
大鼠原代心肌细胞提取方法 原代心肌细胞培养是体外研究心血管疾病相关机制的主要手段和基本技术基础实验中，与细胞系相比，原代心肌细胞的形态及电生理方面更接近在体细胞，因此，培养原代心肌细胞的质量直接关系实验的进程及结果。 乳鼠原代心肌细胞分离须注意以下几点： 1. 鼠龄的选择：新生1-3d龄，最好半日龄。 新生大鼠心肌细胞在出生后3 d内具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞，不再具有分裂增殖能力。因此，大鼠出生时间越短，其心肌细胞分离后成活率越高，越容易贴壁生长。建议选择1~3 d龄大鼠分离其心肌细胞进行原代培养。 2.消化酶的选择：胰蛋白酶和胶原酶混合使用（0.4%胶原酶:0.05%胰酶=2:1）。 常用的消化酶有2种：胰蛋白酶和胶原酶，胰蛋白酶作用较强，容易造成心肌细胞损坏，胶原酶作用较缓和，能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤小。 3.消化程度的把握：组织由红转白呈半透明状态时，停止消化。 新生大鼠心肌细胞对消化酶极为敏感。消化不足，细胞聚集成团，无法得到单层细胞，不利于观察和后续实验；消化过度可使肌原纤维出现萎缩，细胞死亡率增加或丧失贴壁能力及搏动能力；消化的适宜温度为35~37℃。 4.抑制成纤维细胞生长：加入BrdU，更换小牛血清。 分离出来的心肌细胞会伴有较多成纤维细胞，成纤维细胞具有较强增殖能力会干预心肌细胞的贴壁和增殖，需要尽量去除成纤维细胞。成纤维细胞较心肌细胞更容易贴壁，可以通过差速贴壁去除大部分成纤维细胞，但仍有少量成纤维细胞混杂于心肌细胞之中。溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine, BrdU)可干扰细胞的有丝分裂，故常规使用BrdU抑制成纤维细胞的生长。由于胎牛血清所含的促细胞有丝分裂的因子较多，BrdU很难完全抑制成纤维细胞的生长.改用小牛血清则可克服这种现象的出现，获得高达90％以上的心肌细胞。 5.培养液pH值：pH范围在7.2~7.4之间。 操作过程： 手持大鼠乳鼠（出生24h内），75%乙醇消毒皮肤，剪开胸部皮肤，再消毒1次，更换手术器械，弯镊提取心脏，置于盛有PBS（1:50双抗）的大皿中； 将心脏表面附着的大血管剪去，剪去心房，放入5ml灭菌离心管中充分剪碎成肉泥状； 加3ml左右胶原酶和1.5ml 0.05%胰酶充分吹匀，37℃消化8 min，自然沉淀，弃上清，再加3ml左右胶原酶和1.5ml0.05%胰酶，充分吹匀，37℃消化10min； 取上清，3000 rpm 5min，铺中皿加含有10%胎牛血清的DMEM培养基（记1），剩余沉淀中加入3ml左右胶原酶和1.5ml0.5%胰酶，充分吹匀，37℃消化10min； 重复4的步骤4-5次，直至组织块消化完毕，记（2-5） 放培养箱2到3小时待成纤维细胞贴壁后轻轻吹打培养基，所有的中皿上清移入离心管离心3000 rpm 5min，弃上清，加含有10%小牛血清的DMEM培养基以及Brdu（10mM）（1:80），铺中皿培养。 48h换液后可得心肌细胞。观察心肌细胞形态及搏动状况。
心肌细胞2
乳鼠心肌细胞原代培养综述 【摘要】 ：目的 乳鼠原代心肌细胞培养在心血管病防治研究领域应用广泛，但 是心肌细胞成活率、 搏动率， 纯化率过低仍是本技术有待解决的关键之处。 本文 探讨原代心肌细胞培养的条件和方法以及一些注意事项做一下总结。 【关键词】乳鼠 心肌细胞原代培养 1．新生大鼠鼠龄的选择 乳鼠心肌细胞随年龄的增长，其增殖分化能力亦有变化，如在新生3d内，具有部分增殖能力，而成年大鼠心肌细胞为终末分化细胞，不具备增殖能力，因此，我们在选择鼠龄时，尽量选择出生时间短的乳鼠，这样的心肌细胞成活率及贴壁率较高，所以选择新生1~3d均可，最好为半日龄的大鼠更为理想。 2．消化酶的选择使用分离组织常用的消化液有胰蛋白、胶原酶和透明质酸，如依地酸二钠(EDTA)，其作用是利于组织块分散为单个细胞，利于细胞的贴壁生长。消化液的浓度、消化能力、消化的时间、温度对组织离散效果影响较大，甚至会损伤细胞，导致培养细胞状态不佳，失去贴壁生长能力，增加心肌细胞死亡率。其中胰蛋白酶的消化力较强，常用浓度为0·05~0·50%，在37℃、PH8·0条件下作用最强，易造成心肌细胞损坏，因此，有学者认为“单纯应用胰蛋白酶消化对细胞的存活率有极大的负面影响”[1]，而TDTA作为一种化学螯合剂，价格低、毒性小，对细胞有一定的离散作用。所以，选用胰蛋白酶与EDTA联合应用，可降低细胞损害，具有更好的消化分离效果。另外，胶原酶作用较温和，通过水解细胞间胶原蛋白来实现离散组织的目的，对细胞的损伤较小，也是理想的细胞分离液，针对心肌细胞间含有不同胶原酶类型，可联合使用Ⅰ型胶原酶和
Ⅱ型胶原酶。且要知道的是在新生大鼠心肌组织，以胶原I为主，故我们选用胶原酶I，文献报道胶原酶的工作浓度一般在0。61 g·L-1，我们使用的为0。8 g·L-1。胶原酶最好现用现配。 3．污染防治 虽然污染本身是不可能完全避免的，但可以降低其发生率、减轻其产生的严重后果。 因此，我们在细胞培养过程中，要坚持无菌操作的原则，如做好实验室、超净台、实验器械及实验用液的消毒灭菌工作，个人要身着消毒衣帽，佩戴口罩及无菌手套， 操作时，酒精灯火焰烧灼消毒器械，避免培养用液长时间暴露在空气环境，禁止吸管接触培养液瓶口等。防止微生物污染常用的方法是在培养液中加入抗生素，由于抗生素的种类不同，其抗生范围也不尽相同，但多数针对细菌感染为主，常用青霉素和链霉素联合应用。需要指出的是，抗生素的抗生范围有限，且污染发生具有隐匿性，出现后往往后果严重，所以抗生素仍不能替代无菌操作，而且过度的强调抗生素的作用，会使实验者淡化甚至忽视无菌操作，滥用也会导致产生耐药菌，因此，只有无菌操作才是防止细胞污染的最好手段 除了以上说的无菌操作还应特别注意以下几点：(1)获取心脏时避免剪破消化道，比较稳妥的办法是在剑突上一肋处入剪，这样做不涉及腹腔，也就减少了污染机会。(2)如条件允许，应避免乳鼠心肌细胞与其他细胞在同一孵箱内共同培养，以防止发生交叉污染。(3)对于培养心肌细胞的观察、照相每次时间不可过长，否则既会导致培养液pH改变，又能增加污染机率。 4．心肌细胞纯化 在心肌细胞培养中，成纤维细胞具有分裂增殖能力， 且生长迅速， 比心肌细胞更早贴壁，如不加以控制，常可生长为优势细胞。细胞纯化方法有很多因此，目前，常用化学试剂抑制法和差速贴壁分离法来抑制其生长，而化学试剂势必对培养细胞生长环境有一定影响，因此，依据心肌细胞与成纤维细胞贴壁时间不同的原理做差速分离， 成了广泛采用的纯化方法，其优点是对目的细胞影响小，经比较，结果显示差速贴壁在60min、90min时最为理想 方法简便，纯化率较高，可达到95%以上。经差速贴壁后仍有少量成纤维细胞混杂于心肌细胞之中，若处理不当，很容易生长成优势细胞。因此再加上化学试剂抑制，加入分裂抑制剂(如丝裂霉素c) ，有时在培养早期如入溴脱氧脲苷，或加入不利非心肌细胞生长的成分(如谷氨酰胺)。如溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine， BrdU)可干扰细胞的有丝分裂，故常
乳鼠心肌细胞原代培养综述
乳鼠心肌细胞原代培养综述 【摘要】：目的乳鼠原代心肌细胞培养在心血管病防治研究领域应用广泛，但是心肌细胞成活率、搏动率，纯化率过低仍是本技术有待解决的关键之处。本文探讨原代心肌细胞培养的条件和方法以及一些注意事项做一下总结。 【关键词】乳鼠心肌细胞原代培养 1．新生大鼠鼠龄的选择 乳鼠心肌细胞随年龄的增长，其增殖分化能力亦有变化，如在新生3d内，具有部分增殖能力，而成年大鼠心肌细胞为终末分化细胞，不具备增殖能力，因此，我们在选择鼠龄时，尽量选择出生时间短的乳鼠，这样的心肌细胞成活率及贴壁率较高，所以选择新生1~3d均可，最好为半日龄的大鼠更为理想。 2．消化酶的选择使用 分离组织常用的消化液有胰蛋白、胶原酶和透明质酸，如依地酸二钠(EDTA)，其作用是利于组织块分散为单个细胞，利于细胞的贴壁生长。消化液的浓度、消化能力、消化的时间、温度对组织离散效果影响较大，甚至会损伤细胞，导致培养细胞状态不佳，失去贴壁生长能力，增加心肌细胞死亡率。其中胰蛋白酶的消化力较强，常用浓度为0·05~0·50%，在37℃、PH8·0条件下作用最强，易造成心肌细胞损坏，因此，有学者认为“单纯应用胰蛋白酶消化对细胞的存活率有极大的负面影响”[1]，而TDTA作为一种化学螯合剂，价格低、毒性小，对细胞有一定的离散作用。所以，选用胰蛋白酶与EDTA联合应用，可降低细胞损害，具有更好的消化分离效果。另外，胶原酶作用较温和，通过水解细胞间胶原蛋白来实现离散组织的目的，对细胞的损伤较小，也是理想的细胞分离液，针对心肌细胞间含有不同胶原酶类型，可联合使用Ⅰ型胶原酶和Ⅱ型胶原酶。且要知道的是在新生大鼠心肌组织，以胶原I为主，故我们选用胶原酶I，文献报道胶原酶的工作浓度一般在0。61 g·L-1，我们使用的为0。8 g·L-1。胶原酶最好现用现配。 3．污染防治 虽然污染本身是不可能完全避免的，但可以降低其发生率、减轻其产生的严重后果。因此，我们在细胞培养过程中，要坚持无菌操作的原则，如做好实验室、超净台、实验器械及实验用液的消毒灭菌工作，个人要身着消毒衣帽，佩戴口罩及无菌手套，操作时，酒精灯火焰烧灼消毒器械，避免培养用液长时间暴露在空气环境，禁止吸管接触培养液瓶口等。防止微生物污染常用的方法是在培养液中加入抗生素，由于抗生素的种类不同，其抗生范围也不尽相同，但多数针对细菌感染为主，常用青霉素和链霉素联合应用。需要指出的是，抗生素的抗生范围有限，且污染发生具有隐匿性，出现后往往后果严重，所以抗生素仍不能替代无菌操作，而且过度的强调抗生素的作用，会使实验者淡化甚至忽视无菌操作，滥用也会导致产生耐药菌，因此，只有无菌操作才是防止细胞污染的最好手段。除了以上说的无菌操作还应特别注意以下几点：(1)获取心脏时避免剪破消化道，比较稳妥的办法是在剑突上一肋处入剪，这样做不涉及腹腔，也就减少了污染机会。 (2)如条件允许，应避免乳鼠心肌细胞与其他细胞在同一孵箱内共同培养，以防止发生交叉污染。(3)对于培养心肌细胞的观察、照相每次时间不可过长，否则
实验3 细胞核的分离与核酸的鉴定
实验3 细胞核的分离与核酸的鉴定 【实验目的】 1.掌握细胞核及细胞质的分离和纯化的一般原理和操作方法。 2.了解DNA在细胞中的分布和核酸鉴定的原理。 3.进一步掌握离心机的工作原理及正确使用方法。 【实验原理】 1.DNA主要存在于细胞核， RNA主要存在于细胞质。 2.细胞内不同结构的比重和大小都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各组分分级分离出来。 肝组织破碎后，柠檬酸能抑制脱氧核糖核酸酶的活性，维持染色质的正常结构和活性。如将此种细胞核保存在等渗（0.25M）蔗糖溶液中（内含微量钙离子，防止核聚集和脆性），可以比较好地保存其完整的正常结构。 在此条件下离心分离得到的是细胞核的粗制品，如离心时通过0.88M蔗糖的高渗溶液。适当调整离心力，可得到纯化的细胞核沉淀。
3.脱氧核糖核酸的鉴定： 【操作步骤】 1、0.5g肝组织＋5ml的1.5%柠檬酸溶液，研磨 2、肝匀浆，倾入离心管，离心：3000r/min；15′ 3、离心结束后，上清液移入另外一个试管中备用（此为细胞质液） 4、沉淀中加入1ml的0.25mol/L 蔗糖-柠檬酸溶液，玻棒搅匀后， 为核悬液。 5、另外取离心管一只，加9ml 的0.88mol/L蔗糖-柠檬酸液。用滴 管吸取核悬液。沿管壁缓慢铺于液面上。 6、离心：2000r/min；10′.上层液，弃去；沉淀为初步纯化的细 胞核。 7、核洗液5ml洗涤沉淀，离心：2000r/min，10 ′白色沉淀为纯
化的细胞核。 8、加10ml 0.02mol/L NaOH溶解细胞核，即为待测的核液。 9、脱氧核糖核酸的鉴定 （1）水解：取离心管二支，编号，按下表操作 混合各管 沸水浴(10’) 离心 3000r/min;5′ 上清液 (2)鉴定：取试管三支，编号，按下表操作: 混合各管 沸水浴(15’) 冷却 比较各管颜色(595nm) 编号 1 2 细胞质（ml） 2.0 - 核液（ml）- 2.0 1M过氯酸(ml） 2.0 2.0
原代心肌细胞培养方法探讨
原代心肌细胞培养方法探讨1 邵伟（山东省千佛山医院山东济南250014） 周苏宁邵建华（山东大学医学院山东省立医院山东济南250021） 摘要探讨培养Wister新生大鼠心肌细胞的可靠方法。采用心肌组织块差别消化结合化学纯化的培养方法，通过倒置显微镜、HE染色、透射电镜、台盼篮、免疫细胞化学，鉴定心肌细胞生长情况及纯度。结果细胞生长迅速、自行搏动，细胞形态完整，细胞内肌丝、线粒体清晰；细胞成活率达94.6％；肌动蛋白（HHF35）经S-P法胞浆呈现棕褐色阳性表达，纯度达96.4％。表明该方法培养的心肌细胞生长迅速、活性好、纯度高。 关键词心肌细胞；细胞培养；大鼠 Explore a method of neonatal rat myocardial cells in culture ZHOU Suning, SHAO Jianhua. Medical college of Shandong university, the people’s hospital of Shandong province, Jinan 250021, China Abstract To explore a reliable method of neonatal rat myocardial cells in culture. The plots of myocardial tissue from neonatal Wister rat were cultured and purified with the method of differential enzyme and 5-Bromodeoxyuridine-treatment. Microscope, transmission electron microscope, HE stains, Trypan blue stains, immunohistochemical test were determined to identification the cell. The results of myocardial cells grow rapidity, automaticity, shape intact, the cell of filament and mitochondria clearly. The cell viability was up to 94.6% by Trypan blue stains. The cell purity was up to 96.4% by Actin （HHF35）of Streptavidin peroxidase conjunction method. This method of myocardial cells in culture was grown up rapidity, lively well, high purity. Key words Myocardial Cells; Culture; Rat 随着心脏病发病率逐年升高，有关心肌疾病的研究越来越受到重视，快速、理想的心肌细胞培养是深入研究的前提，为此我们进行了原代心肌细胞培养方法的探讨，并对其进行了一系列实验研究，现报道如下。 1材料与方法 1.1 心肌细胞的培养取24h内Wister大鼠，在其心脏跳动时将心脏取下，小心剪取心室组织，用冰PBS液清洗干净后，将组织反复剪成0.5～1mm3的小块，加2～3滴细胞培养液，用吸管轻轻吹打后分次吸取组织块悬液，将其均匀排在75ml培养瓶底壁上，轻轻翻转培养瓶，加入含150ml/L胎牛血清、0.1mmol/L 5-溴脱氧核苷(5-Bromodeoxyuridine；Brdu)的高糖DMEM 3ml培养液，做好标记置于37℃恒温培养箱中30～40min后，待组织块略干能贴于瓶壁上，再缓慢、轻轻地将培养瓶翻转，使培养液浸泡组织块，继续静止培养。每天小心取出培养瓶置于相差显微镜下进行观察，2h后就可见组织块周边有细胞伸出，1天后周围爬满细胞，3～4天后多数连接成片，可进行传代，用吸管轻吹组织块使其脱落移出，加入0.1％胰蛋白酶1ml，放置倒置显微镜下观察，约3～5min后部分细胞呈圆形，在瓶上做好标记，弃去胰 1山东省自然科学基金资助项目（No.Q99C03）
成年大鼠心肌细胞分离方法
成年大鼠心肌细胞分离方法 【摘要】目的: 探讨三种分离成年大鼠心肌细胞的方法。方法: 分别应用酶消化法（0. 1 %的胰蛋白酶和0.1%胶原酶依次消化）、程序冷冻后机械分离法（4℃30min，-20℃30min，-80℃30min，-196℃冻存）、酒精和多聚甲醛固定后机械分离法分离心肌组织获取单个心肌细胞悬液。光镜观察, 结合形态学和台盼蓝染色评价心肌细胞。结果: 用三种方法新分离的活性心肌细胞比率约70 %～80 % 、杆状、横纹清晰。结论: 三种方法均可以对成年大鼠心肌细胞进行良好的分离。 【关键词】大鼠; 心肌细胞; 细胞分离 【ABSTRACT】 Objective: To study the methods of isolating adult rat ventricular cardiomyocytes. Methods: The method of enzyme digestion(0.1% trypsin and 0.1% collagenase by turns) or mechanical method: mechanical isolation after procedure cryoapplication(4℃30min，-20℃30min，-80℃30min，freeze and keep under-196℃) or mechanical isolation after alcohol and paraform fixation was used to isolate cardiac muscular tissues and obtain single cardiomyocyte suspension. The cardiomyocytes were morphologically observed with optical microscope and evaluated through trypan blue dying. Results: Viability of freshly isolated adult rat ventricular cardiomyocytes, which were rod shaped with clear cross striations,was 70%～80%. Conclusion: Adult rat ventricular cardiomyocytes can be
原代新生大鼠心肌细胞的分离与培养
原代新生大鼠心肌细胞的分离与培养 1.动物与仪器 1.1实验动物：选择出生第2 d的SD乳鼠,雌雄不拘。 1.2主要仪器与试剂:二氧化碳培养箱，Olympus倒置显微镜，超净工作台，低速自动平衡离心机,恒温磁力搅拌器；DMEM 培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、D-Hank′s 液、溴脱氧尿核苷、小鼠抗大鼠Sarcomerie actin 单抗；山羊抗小鼠IgG。 2.方法 2.1心肌细胞的分离：取第2 d的SD乳鼠，无菌条件下开胸取心尖部，用预冷的D-Hank′s 液洗涤3遍，将心脏剪成约1mm3大小；用0.0625％的胰酶在37℃恒温磁力搅拌器中消化心肌组织，消化过程中采用分次消化时间(5min×5次,6min×5次,7min×5次,8min×5次)，第一次消化后自然沉淀并弃上清，以后自然沉淀后取上清；每次分离的上清液加等量含10％胎牛血清的DMEM培养液轻轻吹打制成细胞悬液，1 000 r/min离心10 min，重复3次。 2.2心肌细胞的培养:细胞悬液放CO2培养箱培养90min后，采用差速贴壁分离技术,吸收培养瓶中的细胞悬液，调整细胞浓度为5.0×105细胞/mL，将单细胞悬液接种于培养板中，前3 d滴入Brdu使其终浓度为0.1mmol/L，并继续培养；24h后换液,以后隔日换液。 2.3心肌细胞搏动率的观察:在倒置显微镜下观察第1 d至第7 d心肌细胞的生长状态、形态变化，并摄像记录自发搏动频率。随机计数培养至第4 d的心肌细胞的搏动率。细胞搏动率(％)=搏动细胞数／细胞总数×100％。 2.4心肌细胞存活率的测定:取相同量的0.4％台盼蓝液与细胞悬液混匀后再取适量混合液滴于细胞计数板上，随机取10个高倍（20×）视野计数4个大格中的细胞总数及未染成蓝色的活细胞数，计数10次，取平均值。细胞存活率(％)=活细胞数／细胞总数×100％. 2.5心肌细胞纯度的鉴定:取培养72 h后心肌细胞进行纯度鉴定，用横纹肌肌动蛋白(a actin)单克隆抗体作为一抗，用SABC法进行免疫细胞化学染色，用磷酸盐缓冲液（PBS）作为一抗的阴性对照。随机取10个高倍（20×）视野计数阳性细胞及细胞总数。阳性细胞率=阳性细胞数/细胞总数×100％。
心肌细胞培养
新生大鼠心肌细胞培养技巧 原代培养心肌细胞作为一种主要的研究模型，被广泛应用于心血管研究之中 我们实验室经过长期尝试，摸索出了一些行之有效的方法，并积累了一些经验，现总结如下： 1新生大鼠鼠龄的选择新 生大鼠心肌细胞在出生后3d内具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞，不再具有分裂增殖能力因此，大鼠出生时间越短，其心肌细胞分离后成活率越高，越容易贴壁生长大量观测表明，选择1~3d龄大鼠分离其心肌细胞进行原代培养较为理想其中尤以半日龄大鼠心肌细胞培养效果最佳 2消化酶的选择及使用新生大鼠心肌细胞的分离可采用组织块法和消化法，前者因不易获得密度均一的细胞且难控制成纤维细胞的生长而较少采用 . 消化法中常使用的酶有3种：胰蛋白酶、胶原酶I或Ⅱ以及透明质酸酶 透明质酸酶多与胰蛋白酶或胶原酶联合应用胰蛋白酶作用较强，容易造成心肌细胞损坏 .胶原酶作用较缓和，能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤小，且在新生大鼠心肌组织，以胶原I为主,故我们选用胶原酶 I.文献报道胶原酶的工作浓度一般在0.6~1g?L1,我们使用的为0.8gL1.胶原酶最好现用现配. 3消化程度的把握 新生大鼠心肌细胞对酶消化极为敏感 .消化过度可使肌原纤维出现萎缩，细胞死亡率增加或丧失贴壁能力及搏动能力；消化不足，细胞聚集成团，无法分清细胞边界，难以形态学观测 .消化过程中使用磁力搅拌器时应注意 :(1)转速一般控制在60~80rmin1左右 .(2)每次消化的时间须结合消化酶浓度确定.(3)将粘附在搅拌子上的心肌组织吹散，使酶液充分接触组织 .(4)适宜温度为35~37℃
.(5)当组织由红转白呈半透明状态时，应停止消化. 4接种的细胞密度 心肌细胞接种密度不仅影响细胞间的相互接触，进而影响细胞对肥大刺激的反应，而且影响长期培养细胞的成活率接种细胞的绝对数量应经精确计算 . 一般而言，应根据实验的观测目的决定单位面积上的细胞数量.例如，如作形态学观测,六孔板中每孔的接种细胞数量应控制在1×105~2×105个；若需收获心肌细胞作mRNA或蛋白表达水平的观测，则每孔的接种密度可增加到5×105~6×105个. 5细胞的分散度与接种的均匀性分离出的心肌细胞，在溶液中Ca2+作用下较容易出现集聚现象. 因此，在进行差速贴壁前后，均应反复多次地轻柔吹打使心肌细胞成单个分散状.接种后，应小心使心肌细胞均匀地分布于培养板上,避免细胞向培养孔的中央集聚.此外，可将培养板放入孵箱后用滴管轻轻吹打各孔中央部位2~3次，但应格外注意避免污染 6对成纤维细胞的抑制与血清种类的选择成纤维细胞较心肌细胞更容易贴壁且具有分裂增殖能力，经差速贴壁后仍有少量成纤维细胞混杂于心肌细胞之中，若处理不当，很容易生长成优势细胞 .溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine,BrdU)可干扰细胞的有丝分裂，故常规使用BrdU抑制成纤维细胞的生长 .但是，如果使用胎牛血清培养细胞，由于胎牛血清所含的促细胞有丝分裂的因子较多，BrdU很难完全抑制成纤维细胞的生长改用小牛血清则可克服这种现象的出现，获得高达90％上的心肌细胞 . 7 换液时间进行心肌细胞形态学观测时，接种密度较低，贴壁的心肌细胞数量减少，为避免成活心肌细胞随换液而被丢弃，应在接种48h后换液 .这样不仅使贴壁的心肌细胞数量明显增加，而且BrdU作用时间较长，对成纤维细胞的抑制作用更确实 此外，去血清后可用ITS和0.1gL1BSA对心肌细胞进行营养支持，对心肌细胞贴壁率与凋亡率均不产生明显影响 .
细胞生物学：小鼠心肌细胞原代培养
细胞生物学：小鼠心肌细胞原代培养 ㈠、概述 整体动物心肌细胞的增殖能力在出生后仅能维持一个短时期，小鼠在出生3周后DNA合成所需的酶的活性及心肌细胞的增殖能力就明显降低至成年鼠水平。小鼠心肌细胞的原代培养，一般选用生后1-10d的乳鼠心脏，尤以出生1-4d的较好，此时心肌细胞已分化充分，适于作各种研究，而出生4d以后的乳鼠心脏中分离出来的心肌细胞较慢发育成为有自律性搏动的心肌细胞。 ㈡、[试剂] 1、培养液：1：1混合的DMEM/F12培养液，添加终浓度为10%小牛血清（FCS）、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素。 2、消化液：胰酶（效价为1：250）0.08%、胶原酶II（活力为150U/mg）0.05%，用pH7.2-7.8的D-Hanks溶液配制，-20℃保存。 3、D-Hanks溶液（pH7.2-7.8）：KCl0.4g，KH2PO40.06g，NaCl8.00g，NaHCO30.35g，Na2HPO4？7H2O0.09g，酚红0.01g1L ㈢、[实验步骤] 1、取生后1-4d的乳鼠，用75%乙醇消毒皮肤，再用大头针固定乳鼠的头及四肢，剪开胸部皮肤，用75%乙醇消毒皮下组织，更换镊子及剪刀，开胸取出心
脏，将心脏放入盛有D-Hanks溶液的平皿（或青霉素瓶）中，剪去心房，剪开心室，用D-Hanks溶液冲洗三次，去除残留积血后，将心脏剪成1mm3大小的碎片，再将心脏碎片转移至离心管中，加5ml左右消化液，37℃消化5min，自然沉淀，弃上清，再加5ml左右消化液，37℃消化20min（每隔2min振摇几下），用吸管吹打1min后，将未消化完全的心脏碎片吸出至另一离心管中，加入2ml冷的培养液终止消化，1000rpm5min，弃上清，沉淀中加入D-Hanks溶液2ml，1500rpm10min，弃上清，沉淀中加入培养液2ml，用吸管吹打制成细胞悬液。（为节约时间，以下步骤省略）上述未消化完全的心脏碎片补加5ml左右消化液后继续消化，同样操作，合并细胞悬液后放入培养瓶中置二氧化碳培养箱中 （37℃5%CO2）培养。
心肌细胞分离方法
成体SD大鼠心肌细胞分离实验程序溶液配方：
4. 酶液：(NaOH 调节pH 7.35) 4.1 [李超彦.成年SD大鼠心肌细胞分离；2007] 100mL酶液A：胶原酶Ⅰ+胰蛋白酶，100ml无钙台式液+40mg collagenaseⅠ+6mg 胰蛋白酶 45mL酶液B：45ml无钙台式液+18mg collagenaseⅠ 4.2 [王振国.四医大硕士论文。2005] 30mL酶液：30ml无钙台式液+18mg 胶原酶Ⅰ+21mg BSA 5. 复钙液(NaOH 调节pH 7.35) 5.1 20mL复钙液A: 20mL无钙台式液+10mgCaCl2+20mg BSA。 20mL复钙液B: 20mL无钙台式液+20mgCaCl2+20mg BSA。 20mL复钙液C: 20 mL台式液+20mg BSA。 5.2 100mL复钙液A: 100mL无钙台式液+1.1mgCaCl2, 100mg BSA。 100mL复钙液B: 100mL无钙台式液+5.5mgCaCl2，100mg BSA。 50mL复钙液C: 50 mL台式液+50mg BSA。 5.3 [李超彦.成年SD大鼠心肌细胞分离；2007] 复钙液A: 取无钙台式液加入CaCl2至0.1mmol/L,BSA至1 mg/ mL 复钙液B : 取无钙台式液加入CaCl2 至0.5mmol/L，BSA至1 mg/mL 复钙液C: 取台式液加入BSA 至1 mg/ mL 。 6.心肌细胞分离 其步骤简述如下： 1.3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠（30mg/kg体重） 2.迅速开胸取出心脏并置于冰浴下的含氧台式液中，使心脏剧烈收缩排出心腔内 残留的血液，然后迅速将心脏固定于Langendorff灌流系统上。 3.经主动脉灌流（37℃）含氧无钙台式液 4.心脏停跳后，换以含胶原酶Ⅰ（0.6g/L）和牛血清蛋白（BSA,0.7g/L）的无钙 台式液灌流约10min 5.心脏变松软，灌流液流出速度明显加快后，再换以无钙台式液灌流冲洗残留酶 液约2min。 6.去除新房及主动脉，并将心室组织置于含2%BSA的含氧KB（37℃）液中。 7.将心室组织剪碎，以粗头吸管轻轻反复吹打并经200目筛网过滤细胞悬液。 8.室温静置10min沉降分离心室肌细胞（一说100×离心5min），保留沉淀并换入 新鲜含2%BSA的KB液。 9.静置40min后逐步复钙至终浓度1.8×10-3mol/L（一说1.25×10-3mol/L）,得到钙 耐受心室肌细胞，保存于含1.8×10-3mol/L CaCl2的台式液中备用。 另一说： 8. 250目尼龙网过滤，静置10min，弃上清液，加入复钙液A 5-7mL，静置复钙15min( 使心肌细胞自然沉降) ，弃上清液后加入复钙液B 5mL 静置复钙15min，弃上清加入复钙液C，静置15min备用。 9. 暗室中负载Fura-2 AM Ca2+ 荧光探针染色，500μL台式液加1μL DMSO（二甲基亚砜）溶解的Fura-2 AM Ca2+ 荧光探针。15min后缓慢颠倒混匀，15min之后上
原代心肌细胞培养技巧【转】
作者：王涛，余志斌，谢满江，车红磊 【关键词】细胞培养 【关键词】细胞培养；心肌细胞；大鼠 引言原代培养心肌细胞作为一种主要的研究模型，被广泛应用于心血管研究之中。我们实验室经过长期尝试，摸索出了一些行之有效的方法，并积累了一些经验，现总结如下： 1. 新生大鼠鼠龄的选择 新生大鼠心肌细胞在出生后3 d内具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞，不再具有分裂增殖能力。因此，大鼠出生时间越短，其心肌细胞分离后成活率越高，越容易贴壁生长。大量观测表明，选择1~3 d龄大鼠分离其心肌细胞进行原代培养较为理想。其中，尤以半日龄大鼠心肌细胞培养效果最佳。 2. 消化酶的选择及使用 新生大鼠心肌细胞的分离可采用组织块法和消化法，前者因不易获得密度均一的细胞且难控制成纤维细胞的生长而较少采用。消化法中常使用的酶有3种：胰蛋白酶、胶原酶I或Ⅱ以及透明质酸酶。透明质酸酶多与胰蛋白酶或胶原酶联合应用。胰蛋白酶作用较强，容易造成心肌细胞损坏。胶原酶作用较缓和，能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤小，且在新生大鼠心肌组织，以胶原I为主,故我们选用胶原酶I。文献报道胶原酶的工作浓度一般在0.6~1 g ?L，我们使用的为0.8 g?L。胶原酶最好现用现配。 3. 消化程度的把握 新生大鼠心肌细胞对酶消化极为敏感。消化过度可使肌原纤维出现萎缩，细胞死亡率增加或丧失贴壁能力及搏动能力；消化不足，细胞聚集成团，无法分清细胞边界，难以形态学观测。消化过程中使用磁力搅拌器时应注意：(1)转速一般控制在60~80 r?min左右。(2)每次消化的时间须结合消化酶浓度确定。(3)将粘附在搅拌子上的心肌组织吹散，使酶液充分接触组织。(4)适宜温度为35~37℃。 (5)当组织由红转白呈半透明状态时，应停止消化。 4. 接种的细胞密度 心肌细胞接种密度不仅影响细胞间的相互接触，进而影响细胞对肥大刺激的反应，而且影响长期培养细胞的成活率。接种细胞的绝对数量应经精确计算。一般而言，应根据实验的观测目的决定单位面积上的细胞数量。例如，如作形态学观测，六孔板中每孔的接种细胞数量应控制在1×105~2×105个；若需收获心肌细胞作mRNA或蛋白表达水平的观测，则每孔的接种密度可增加到5×105~6×105个。
细胞生物学设计性实验：细胞核的分离鉴定
细胞生物学设计性实验：细胞核的分离鉴定 医学细胞生物学设计型实验设计报告 班级10级k-7班 评分 实验项目： 细胞核的分离与鉴定 实验原理：1、细胞内各种结构的比重和大小不同，在同一离心场内其沉降速度也不同。所以，用差速离心法可将细胞内各种细胞器及组分分级分离出来。差速离心法也是用来研究亚细胞成分的化学组成，理化特性及其功能的主要手段。 2、分离细胞核最常用的方法是将组织制成匀浆，在特定的条下进行离心分离，然后分析鉴定。 3、匀浆是指在低温条下，将组织放入匀浆器，加入等渗匀浆介质进行研磨，破碎细胞，使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆液。 实验步骤：1、处死：断头处死小白鼠，手提尾部使其学业尽量流出。 2、取材：迅速开腹取肝，在盛有生理盐水的小烧杯中反复洗涤，称取湿重约为1g的肝组织放在烧杯中。 3、匀浆：加油8ml预冷的0.25mol/L蔗糖0.003mol/L绿化高永夜于烧杯中，尽量剪碎肝组织，将剪碎的刚组织倒入玻璃匀
浆器，是匀浆器下端侵入盛有冰块的器皿（如冰盘）。左手握持匀浆器，右手将匀浆捣杆垂直插入管中匀浆，直至看不到明显的组织块。 4、过滤： 用8层纱布（先用少量生理盐水或蔗糖液润湿纱布）过滤匀浆液于离心管中。 5、离心：在天平上平衡每对离心管，2500r/min离心 15min，取上清液于另一离心管中。 6、涂片：取上清液制一张涂片（涂片1）。将原离心管中剩余上清液吹打成沉淀成悬液，另制一张涂片（涂片2），自然干燥。 7、染色：分别在涂片1和2上低价甲苯胺蓝染液 ，染色5到7分钟（即滴染）。 8、洗涤：冲去染液，晾干。 9、镜检：结合实验结果的描述，镜下观察分析。 注意事项：1.操作规范，防止试剂污染。 2.细胞悬液的涂片制作要轻柔。 3.使用离心机要注意平衡，转速从低到高。 预期结果：低倍镜下找到标本，再换高倍镜，可见肝细胞核已游离出来，被染成蓝紫色，圆形，中央有2到4个甚至更多个深蓝色的核仁。 实验用品：材料：小白鼠肝脏。
大鼠心肌细胞原代培养
实验二大鼠CM的体外分离、培养及鉴定 1、材料与方法 1.1 材料 1.1.1实验动物新生3天清洁级Wistar大鼠乳鼠（中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心，动物许可证号：scxk2005-0001）。 1.1.2主要仪器与试剂 5％CO 2恒温培养箱（model TC2323 CO 2 incubator）；倒 置相差显微镜（XD-101 98010）；PH计（mettler toledo320-s）；立式自动电热压力蒸汽灭菌器（LDZX-40BI），上海申安医疗器械厂；SW-CJ-2FD型单人双面净化工作台；微量移液枪（法国Gilson）；血球记数板（上海市沪江医疗器材经营部）；HH-6数显恒温水浴锅；离心机（LDZ5-2）；75cm2培养瓶、50ml离心管（美国corning公司）；无菌手术器械；磁力搅拌器；电子天平板（BS1101S 德国）；一次性滤器（22μm, GILSON）；DMEM/F12培养基 (美国GIBCO)；特级胎牛血清（FBS， Hyclone）；青、链霉素（Hyclone）；D-Hank’s液（NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4、NaOH、NaHCO3，苯酚红,南京化学试剂厂）；心肌肌钙蛋白T(Santa cruz) ;FITC连接的兔抗山羊IgG(Santa cruz);Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶(Sigma)；Triton-X-100(AMRESCO);BrdU(solarbio)。 1.2方法 于无菌操作下开胸取出心脏，仔细去除心脏相连大血管和心房组织（留心尖部），于4℃的D-Hank’S液中漂洗3～4次，以去除残存血液，眼科剪将心尖部组织剪成1 mm3碎块后，加入4 ml的0.0625%胰蛋白酶液，于37℃恒温水浴箱中消化3 min，然后弃上清。于剩余沉淀中加入混合消化液5 ml（0.0625％胰蛋白酶+0.1％Ⅱ型胶原酶），置37℃水浴消化8～10 min，其间振荡2～3次，静置后将上清液移入离心管中，加含10％胎牛血清预冷的DMEM/F12培养液终止消化。 随后用上述方法反复消化7～8次至组织块基本消化完毕。收集各次上清液并终止消化后，200目的尼龙网筛过滤去除残留组织块，以1000 r/min速度离心8 min，将所得的细胞与培养液混悬后，采用差速贴壁分离法去除心肌成纤维细胞每次2 h，将未贴壁的心肌细胞悬液吸出，调整细胞密度接种于培养板中。培养前3 d加入0.1 mmol/LBrdU抑制成纤维细胞生长。48 h首次换液，以后根据情况2～3 d换液。