分离心肌细胞

急性分离大鼠心肌细胞：
1，准备工作：
a，器械：恒温水浴锅，langendorff装置，氧气，剪刀，止血钳，平镊，弯镊，眼科剪，平皿2个，500ml烧杯2个，100ml量筒1个，100ml注射器1个，1ml注射器2个，试管5-7个，吸管2个
b，液体：母液，NaOH(3mol/L),CaCl2(0.9mol/L),葡萄糖（细胞营养），II型胶原酶，BSA（胎牛血清蛋白，心肌细胞保护作用使其不至被酶损害），KB液（细胞保存液）。

2，步骤：
a，打开水浴锅，调节温度到37-37.5℃，提前拿出-20℃的KB液放在水浴锅中融化。

b，洗涤所有玻璃器皿，并用去离子水冲洗。

c，用去离子水从上倒入冲洗langendorff装置，用注射器从装置下端打入弯管中冲洗3遍。

最后用少量去离子水液封装置，避免灰尘进入。

d，配制无钙液：60ml台氏母液＋540ml去离子水＋葡萄糖1.2g（100ml/0.2g），充氧30-50min （一般可充40min），用NaOH调节PH至7.35-7.40。

e，配制有钙液：每100ml台氏液加0.2ml CaCl2，混合均匀。

一般取300ml无钙液。

f，酶液配制：10mg II型胶原酶＋10mgBSA＋50ml无钙液溶解（酶液在取挂心脏结束后，再配制，避免酶液降解；先称取的酶应放于抽屉中避光保存。

）
g，将有钙液用注射器从langendorff装置下端打入弯管中至上端脖颈处，注意不要有气泡，并将无钙液从装置上端倒入，打开氧气，将氧气针头插入langendorff管内。

（PS：如果出现气泡反复挤压灌流装置下端胶管，将气泡挤到弯管上端）
h，将针头安装在langendorff装置最下端，注意不要有气泡。

（PS：可将三通装置的灌流方向堵住，轻推注射器使有钙液流出，用液体流的冲击力冲破针头安装处的表面张力，消除气泡。

）
i，取成年大鼠一只，雌雄不限，给一定剂量的麻药（依据体重）将大鼠麻倒。

(或断髓) j，打开恒温水浴锅外循环，维持灌流液温度。

k，取心脏，挂心脏(取时速度要快，避免心腔淤血，影响灌流)
（１）用止血钳夹住剑突下皮肤，剪刀垂直向下剪，待剪开皮肤后，水平向两侧剪，注意不要剪开胸膜。

（２）用止血钳夹住剑突，剪开膈，从顶部剪，暴露心脏，撕开心包膜，用弯镊将肺向下拉，带动心脏向下，注意镊子不要碰触心脏，用眼科剪将主动脉剪断，用左手轻拖住心脏，将心脏取下。

（３）将心脏放入预先4℃保存的有钙液中，并置于冰上修剪心脏，有血液泵出，或肺动脉圆锥附近，即为主动脉，用镊子和剪刀将主动脉的边缘修剪平整。

（PS：在修剪心脏时维持低温环境是减轻心脏跳动力，影响修剪。

修剪时，不要将心脏提出液体外，避免空气进入，影响灌流。

可将主动脉口用直镊夹住，然后用直剪进行修剪。

）（４）将langendorff装置打开一半，注意液体流速不要太快，成股即可，用平镊和弯镊将主动脉夹住（PS：不要将主动脉夹伤），顺着液体流提升并悬挂于langendorff装置下端针头处，不要太深，最后用平镊夹住主动脉，在贴近平镊下方用线系紧主动脉。

l，完全放开langendorff装置阀门，让液体以恒速流入心脏，由于流速较快，注意管上方要保持有液体，否则有大量气泡进入弯管，造成分离失败。

m，一直用无钙液冲洗心脏，至心脏颜色变浅，冠脉突出，心脏停止跳动。

（PS：右心房是最后停跳的。

）
n，用酶液进行消化，待心脏停止跳动5-8min加入酶。

（PS ：有争议，通常实验时心脏一停跳，就加入酶消化。

但过多的钙存在时，应用胶原酶或蛋白酶会引起心肌细胞膜破裂。

）o，用50ml烧杯，接取前20ml流下的液体弃去，自此后接取的消化液要循环利用，消化开始，开始计时，计滴速。

p，消化过程，滴速由快变慢，由慢迅速变成滴下的液体有拉丝，心脏表面变粘（胶原等物质在消化液中存在），消化20-25min（仅做参考，冬夏季消化时间有差异），至表面韧性变低即可。

t，KB液充氧后，微调PH至7.20，将KB液装入标好的离心管中，分别剪右室，室间隔，左室，剪碎组织，放入离心管中吹打，弃去组织。

r，将细胞悬液放入4℃冰箱中稍静置1h。

PS：消化判断终点时，可先终止灌流，剪下右室下方组织，吹散在显微镜下观察细胞活性，决定灌流是否继续。

或者可先将灌流装置终止，用手慢慢轻压心脏，避免伤害心脏，将心腔中消化液挤出，观察心脏形变不恢复即可。

消化不要过。

有钙液和细胞悬液必须放于4℃贮存待用（尤其在夏季），否则会造成细菌污染，影响实验。

Tips：有钙液灌流—让心脏跳动，心腔中的血泵出；灌流时不至于淤血堵塞血管，影响灌流。

无钙液灌流—将心腔中的有钙液冲洗出，使心脏停止跳动；加入的无钙液不能过多，否则细胞不耐钙，分离出的细胞抖。

酶消化液灌流—消化连接心肌细胞的胶原等结缔组织，使心肌细胞分离。

灌流液应始终维持氧饱和，不使心肌细胞缺氧。

通常分离大鼠心肌细胞采用胶原酶，而分离豚鼠心肌细胞采用蛋白酶。

用无钙液冲洗时，使心脏组织疏松，灌流滴数加快，若滴数无明显变化为灌流不完全。

可用平镊夹持系线处水平旋转心脏，使灌流充分。

膜片钳使用流程
１，打开总稳压电源
２，打开不间断电源，数模转换器电源
３，打开显微镜开关
４，实验准备
５，打开电脑，放大器，进行试验
６，实验结束后，先关闭放大器
７，关闭电脑—显微镜—清理试验台
８，检查三维液压是否归零，检查显微镜，检查粗调是否归中，检查氮气是否关闭
９，清理实验室，并闭室内电源，水闸
打开电脑→将桌面上clampex软件打开→File→set Date File Index→向上→D盘→ftm→date →点新建文件图标→修改文件名，并将下面4个数字归零→保存关闭→clampex软件左上方图标（open protocol）→向上→D盘→ftm→protocol→#protocol#→zero pro→打开放大器→MAND至on→记录电流调I及V-clamp→有钙液灌流，洗细胞，压好液接电位，形成电流回路→按Ω0钮（seal test）→上电极时应注意，不要将银丝碰弯，碰断；找电极，电极入液，显示电极阻值（1-3MΩ）若入液后，电极阻值达到KΩ，则说明电极尖断了，应将电极出水换电极→先粗调，后微调将电极针压上细胞，电极阻值上升大约0.5 MΩ说明电极已压上细胞→full scale→调转PIPETTE OFFSET钮，调基线，使电流归零→负压吸引并维持负压，阻值约20 MΩ时，调节钳制电位Holding -20，-40，-60mv基线平稳缓慢调节→使阻值上升至约100-120MΩ时，将负压放掉使阻值继续上升，电流下降，在维持基线平稳的基础上，为保证阻值上升，给予适当的负压→直至基线归零“平”并且阻值上GΩ，给予负压吸引“破”膜，并记录电流（记录中需维持负压，防止破开的膜关闭）→Edit保存至新建文件夹→记录结束后需记录最大膜电容。

打开放大器→MAND至on→记录动作电位→调V及I-clamp NORMAL→记录。

PS：同一细胞可记录多次，但如果每次重新破膜，需重新记录膜电容。

确定细胞是否破膜：①MAND至OFF→调I RMS→电流值在3左右，即可确定破膜→重调至I，on→记录电流。

②观察电流夹角变得光滑，即可确定破膜。

确定破膜后，若基线未平，说明有漏电流，需补leak→调转leak钮，补充漏电流。

重新记录电流和最大膜电容。

PS：放大器开关：power开，调I及V-clamp，再打开控制电钮；
关，先关控制电钮，track，V-track，再关power。

调节条件，在关闭控制电钮时才可进行。

放大器打开后至少1h方可关闭。

PS：开始试验前20min用有钙液贴槽子，恢复细胞耐钙，并使细胞贴壁，细胞不用过多；贴好槽子后，可用灌洗液（有钙液）灌洗细胞表面（速度要慢，避免贴壁细胞被吹起；灌洗装置为自制的注射器抽吸装置，每次替洗1/5浴液，清洗到视野清晰即可），使细胞表面光滑，有利于与微电极尖端形成高阻封接；使用显微镜前先将三维液压调到1左右，并在上下0.5的范围内使用；使用显微镜找电极，先粗调，用细胞找电极，然后用微调压住细胞，开始试验。

微电极的制备
1，采用两步拉制法，拉制电极（垂直拉制）
（１）设定两步拉制的温度step1:72℃；step2:51.9℃。

（２）将毛细玻璃管放在拉制仪上，打到step1的温度，拉出一个7-10mm的细杆
（３）再从细杆的中间偏下部位，用step2温度，将杆拉断，拉出两根玻璃电极
PS：拉制好第一步后，需等电极冷却后，拉制第二步，否则会使电极尖端变短变粗，电极阻值变大，影响实验。

2，充灌电极液
微电极在使用前要充灌电极液，用注射器将电极液充入玻璃微电极中，在充灌过程中，应尽
量避免电极内出现气泡，如出现了可将电极尖端向下，轻敲壁除去气泡。

PS：微电极应拉制的长短均匀，电极阻值相近，方便实验，一般拉制成功后，有1~3MΩ的电阻，常用于全细胞记录模式。

避免碰触微电极尖端，灰尘进入堵住电极，影响试验。

充灌电极液不应过多，大概1cm。

充灌时首先将电极尖端浸入电极内液，利用毛细管虹吸作用使尖端部分充满液体，然后再从电极尾端充灌。

在充灌中应避免电极内出现气泡，如有气泡可使电极尖端向下，轻敲管壁除去。

也应避免充灌电极内液太多，否则电极内液溢出会使支持器表面变湿、形成薄膜而产生热噪声，影响实验噪声基线。

用仪器记录数据
在细胞进行封接以前，要用有钙液灌流复钙（约20min），使心肌恢复正常，才能记录心肌细胞中各种电位及动作电位。

PH剂较正操作步骤：
1，准备：（1）电极，仪表的BNC插头，连接温度传感器到HTC
（2）用变压器把仪表连接到电源
（3）按PH（mv）键，设置PH模式
2，较正：（1）按set up，显示“clear buffer”按Enter
（2）按set up，直至显示缓冲液组“1.68,4.01,6.86,9.18,12.46”或所需的其他缓冲液组，按Enter
（3）将电极清洗，擦干，浸入第一种4.01缓冲液中，等数值稳定，出现s时，按standarize，仪器自动校准，如时间较长，可按Enter手动校准，作为第一点校准，被储存显示“”。

（4）清洗电极，擦干，放入6.86缓冲液中，校准方法同上，但显示“”和**% “slape x good electrode”**显示测量的电极斜率，如在90-105%范围内可接受，如不，则证明与理论值有较大差异，应重新校正，显示“Err”。

（5）再清洗电极，擦干，放入9.18，再进行校正，一般为3点校正。

一些常用的液体成分：
，IK，Ito）母液(台母)
CaCl2 1.8 147.03
0.9mol/L每100ml无钙液中加0.2mlCaCl2（0.9mol/L：6.6g/50ml）
用NaOH调PH值（7.40，一般7.35以上即可）
NaOH配制：3.6gNaOH溶于30ml去离子水中
２，配制KB营养液（细胞保存液）
用KOH调节PH至7.35
用5mol/L KOH调节PH（28gKOH溶于100ml去离子水中）
PS:先直接加固体KOH调节至7.2左右，再加液体KOH。

KB液溶解缓慢，在未完全溶解前加入固体KOH有助于KB液快速溶解。

溶解后4℃静置一宿，分装于用去离子水冲洗过的50ml细胞培养瓶中，并与-20℃冻存。

３，电极液
用1mol/L KOH调PH至7.20。

PS：电极内液需经0.2μm的滤膜或滤纸过滤。

电极液配置好后需分装于1.5ml EP管中，并-20℃冻存。

实验前需先解化，实验过程中应始终置于冰袋上使用。

4，测IKr电流用液体：
电极内液：20ml
实验加：
CaCl2 2 147.03 1.47
Clucose 10 198.2 9.91
用tris-OH(3M为其浓度—0.899g+30ml—mM x 10-3V(L)=g )调节PH至7.4 终液：每1000ml需Glu 1.982g ；CaCl2 2.22ml 0.9M。