多重PCR法和第二代杂交捕获法检测高危型人乳头状瘤病毒分析比较

多重PCR法和第二代杂交捕获法检测高危型人乳头状瘤病
毒的分析比较
【摘要】目的比较并分析多重pcr法和第二代杂交捕获法（hc2）检测13种高危型人乳头瘤病毒（hpv）的结果。

方法分别采用hc2法与多重pcr检测hpv dna，以细胞学诊断分组比较hpv 阳性率，通过统计学方法比较分析两种检测方法在检测结果中的一致性。

结果多重pcr检测结果显示，在175例受检妇女中，137例为阴性，38例为阳性，检测阳性率为21.74%，hc2法检测结果显示，135例为阴性，40例为阳性，检测阳性率为22.86%；未见上皮内病变或恶性病变组（nilm）的13种hr-hpv阳性率为9.1%，低于宫颈细胞异常组的阳性率84.38%，差异有统计学意义（p<0.05）；hc2法和多重pcr法检测结果一致性较强（kappa值为0.868）。

结论多重pcr法与hc2法检测相比一致性强，特异性、灵敏度高，可以与细胞学或者组织病理学检查结合以提高其准确性。

【关键词】多重pcr；hc2法；高危型人乳头状瘤病毒
文章编号：1004-7484（2013）-02-0532-02
妇女生殖道hpv感染是一类常见疾病，据有关报道，在美国至少有80%的妇女到50岁时有过一次hpv感染史。

研究证实hpv感染是宫颈上皮内瘤变（cin）和宫颈癌的主要病因，而且不同hpv亚型感染的致病性和后果也有差异。

hpv分型检测对临床cin和宫颈癌筛查和评估、治疗后的随访、病程的进展监测以及人群的流行病
学状态和病毒疫苗的研制都有重要意义。

目前用于临床的hpv检测技术主要有杂交法与pcr，本研究建立一种多重pcr方法，与第二代杂交捕获法（hc2）同时检测13种高危型人乳头瘤病毒，细胞学诊断做为依据对检测结果进行分析和评价，现报道如下。

1 资料与方法
1.1 临床资料选取2011年1月至2011年12徐州医学院第二附属医院门诊和体检中心患者175人作为研究对象，按以下标准纳入：①年龄为18-60岁的妇女；②具有性生活史；③自愿接受细胞学和hr-hpv病毒学检查。

患者年龄从18-59岁，平均年龄33.5岁。

hr-hpv和细胞学标本均在受检者宫颈口鳞、柱状上皮交界处采集，hpv检测标本使用一次性棉拭子采集，宫颈细胞学检查标本利用专用采集器采集。

1.2 实验方法
1.2.1 组织学诊断指标根据2001年贝塞斯达分类系统（the bethesda system，tbs），将宫颈鳞状上皮细胞学检查结果分为未见上皮内病变或恶性病变（nilm）、意义不明的非典型鳞状上皮细胞增生（ascus）或不排除高度病变的非典型鳞状上皮细胞增生（asc-h）、鳞状上皮细胞低度病变（lsil）、鳞状上皮细胞高度病变（hsil）和宫颈鳞癌（scc）。

1.2.2 第二代杂交捕获法（hc2）检测采用美国digene公司提供的试剂盒，通过基因捕获技术检测hpv（16，18，31，33，35，
39，45，51，52，56，58，59，68），plu/co比值大于或等于1.0诊断为hpv阳性，依说明书采样。

采样的具体方法：用专用配套采样器采集保存宫颈细胞标本1份，受检者取膀胱截石位，暴露子宫颈，窥阴器暴露宫颈后，将专用宫颈细胞采集刷伸入宫颈管内按顺逆时针方向旋转各3-5圈，取出迅速将收集的细胞保存在专用的装有固定液的收集管中。

1.2.3 多重pcr法采用德国qiagen公司的qiaamp dna mini kit 抽取样品病毒基因组dna。

具体步骤参考产品说明书。

做13种hpv 亚型引物设计，进行型特异基因和内参基因的pcr扩增。

采用25μlpcr反应体系，其中含extaq12.5μl，上、下游引物各（1μmol/l）2.5μl，dna模板1μl，灭菌双蒸水补足至25μl。

扩增条件为94℃，10min；（95℃，30s；56℃，30s；72℃，30s）×35循环；72℃，10min，取5μl扩增产物，2.0%琼脂糖凝胶电泳。

稳压150v，置于凝胶成像系统记录结果。

1.3 统计学分析采用spss13.0对数据进行χ2检验及相关分析比较两种hpv检测方法的一致性和相关性分析。

2 结果
2.1 细胞学检查结果 175例受检妇女宫颈细胞学检查结果显示，143例为nilm，另外32位则提示存在细胞学异常，细胞学异常比例为18.3%，细胞学异常者包括ascus16例、lsil12例、hsil4例。

2.2 hc2法和多重pcr法检测结果多重pcr检测结果显示，137例受检妇女为阴性，38例为阳性，检测阳性率为21.74%（38/175）。

nilm组的13种hr-hpv阳性率为7.70%（11/143），低于宫颈细胞异常组（包括ascus、lsil和hsil组）的阳性率84.38%（27/32），差异有统计学意义（p<0.05）。

hc2法检测结果显示，135例受检妇女为阴性，40例为阳性，检测阳性率为22.86%（40/175）。

nilm组的13种hr-hpv阳性率为9.1%（13/143），低于宫颈细胞异常组（包括ascus、lsil和hsil组）的阳性率84.38%（27/32），差异有统计学意义（p<0.05）。

两种检测方法相比结果差异无统计学意义，见表1。

2.3 hc2法和多重pcr法检测结果一致性比较以hc2法结果为参照标准，根据诊断试验评价四格表（表2），计算多重pcr检测hpv dna的敏感性、特异度、准确性、阳性预测值、阴性预测值分别为87.5%、97.8%、95.4%、92.1%、96.4%，具有较高的诊断价值。

并且两种方法通过一致性检验，kappa值为0.868，一致性强。

3 讨论
通过检测发现，hpv感染率在nilm组明显低于在宫颈细胞异常组。

说明hpv的感染与宫颈的病变有明显的相关性。

但是cin各组间比较无显著性差异，表明多重pcr法和hc2法检测hr-hpv病毒载量与宫颈病变严重程度无关。

此研究结果与有关文献报道存在差别[1]，可能与研究对象的区域性等因素有关。

多重pcr与hc2法
在hpv检测结果有较小的差异，说明两种方法有较好的一致性。

本研究通过两种方法对13种hpv亚型检测，最多的四种亚型为：hpv58、hpv16、hpv18、hpv33，检测结果与相关文献报道一致[2]。

也有文献显示，hpv52在患者中阳性率也较高，本研究结果与文献结果相一致。

由于宫颈细胞标本采集难于标准化，故每次检测时收集到的hr-hpv感染细胞多少存在差异，所以对于利用多重pcr法检测到的hr-hpv病毒载量，其只能代表检测样本中的病毒含量，并不完全等同于患者体内实际的病毒含量，并且当存在多种hr-hpv 合并感染时，多重pcr法检测出的病毒载量则是其总和。

综上所述，多重pcr法与杂交法检测相比具有时间短、操作简单、交叉污染少、可以允许同一反应分析更多的基因亚型、可适用于大批量样本的筛查等优点。

该方法可用于宫颈病变的初筛，但不能单独用于宫颈病变的确诊，应与细胞学或者组织病理学检查结合以提高其准确性。

参考文献
[1] 肖克林，王辉林.多重实时pcr检测高危型人乳头瘤病毒感染[j].中华检验医学杂志，2011，34（6）：534-537
[2] 陈斌，周小棉.多重聚合酶链反应联合芯片电泳在人乳头瘤病毒基因分型检测中的应用[j].中华检验医学杂志，2010，33（4）：352-355.。