多重PCR法和第二代杂交捕获法检测高危型人乳头状瘤病毒分析比较

多重PCR法和第二代杂交捕获法检测高危型人乳头状瘤病

毒的分析比较

【摘要】目的比较并分析多重pcr法和第二代杂交捕获法（hc2）检测13种高危型人乳头瘤病毒（hpv）的结果。方法分别采用hc2法与多重pcr检测hpv dna，以细胞学诊断分组比较hpv 阳性率，通过统计学方法比较分析两种检测方法在检测结果中的一致性。结果多重pcr检测结果显示，在175例受检妇女中，137例为阴性，38例为阳性，检测阳性率为21.74%，hc2法检测结果显示，135例为阴性，40例为阳性，检测阳性率为22.86%；未见上皮内病变或恶性病变组（nilm）的13种hr-hpv阳性率为9.1%，低于宫颈细胞异常组的阳性率84.38%，差异有统计学意义（p<0.05）；hc2法和多重pcr法检测结果一致性较强（kappa值为0.868）。结论多重pcr法与hc2法检测相比一致性强，特异性、灵敏度高，可以与细胞学或者组织病理学检查结合以提高其准确性。

【关键词】多重pcr；hc2法；高危型人乳头状瘤病毒

文章编号：1004-7484（2013）-02-0532-02

妇女生殖道hpv感染是一类常见疾病，据有关报道，在美国至少有80%的妇女到50岁时有过一次hpv感染史。研究证实hpv感染是宫颈上皮内瘤变（cin）和宫颈癌的主要病因，而且不同hpv亚型感染的致病性和后果也有差异。hpv分型检测对临床cin和宫颈癌筛查和评估、治疗后的随访、病程的进展监测以及人群的流行病

学状态和病毒疫苗的研制都有重要意义。目前用于临床的hpv检测技术主要有杂交法与pcr，本研究建立一种多重pcr方法，与第二代杂交捕获法（hc2）同时检测13种高危型人乳头瘤病毒，细胞学诊断做为依据对检测结果进行分析和评价，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料选取2011年1月至2011年12徐州医学院第二附属医院门诊和体检中心患者175人作为研究对象，按以下标准纳入：①年龄为18-60岁的妇女；②具有性生活史；③自愿接受细胞学和hr-hpv病毒学检查。患者年龄从18-59岁，平均年龄33.5岁。hr-hpv和细胞学标本均在受检者宫颈口鳞、柱状上皮交界处采集，hpv检测标本使用一次性棉拭子采集，宫颈细胞学检查标本利用专用采集器采集。

1.2 实验方法

1.2.1 组织学诊断指标根据2001年贝塞斯达分类系统（the bethesda system，tbs），将宫颈鳞状上皮细胞学检查结果分为未见上皮内病变或恶性病变（nilm）、意义不明的非典型鳞状上皮细胞增生（ascus）或不排除高度病变的非典型鳞状上皮细胞增生（asc-h）、鳞状上皮细胞低度病变（lsil）、鳞状上皮细胞高度病变（hsil）和宫颈鳞癌（scc）。

1.2.2 第二代杂交捕获法（hc2）检测采用美国digene公司提供的试剂盒，通过基因捕获技术检测hpv（16，18，31，33，35，

39，45，51，52，56，58，59，68），plu/co比值大于或等于1.0诊断为hpv阳性，依说明书采样。采样的具体方法：用专用配套采样器采集保存宫颈细胞标本1份，受检者取膀胱截石位，暴露子宫颈，窥阴器暴露宫颈后，将专用宫颈细胞采集刷伸入宫颈管内按顺逆时针方向旋转各3-5圈，取出迅速将收集的细胞保存在专用的装有固定液的收集管中。

1.2.3 多重pcr法采用德国qiagen公司的qiaamp dna mini kit 抽取样品病毒基因组dna。具体步骤参考产品说明书。做13种hpv 亚型引物设计，进行型特异基因和内参基因的pcr扩增。采用25μlpcr反应体系，其中含extaq12.5μl，上、下游引物各（1μmol/l）2.5μl，dna模板1μl，灭菌双蒸水补足至25μl。扩增条件为94℃，10min；（95℃，30s；56℃，30s；72℃，30s）×35循环；72℃，10min，取5μl扩增产物，2.0%琼脂糖凝胶电泳。稳压150v，置于凝胶成像系统记录结果。

1.3 统计学分析采用spss13.0对数据进行χ2检验及相关分析比较两种hpv检测方法的一致性和相关性分析。

2 结果

2.1 细胞学检查结果 175例受检妇女宫颈细胞学检查结果显示，143例为nilm，另外32位则提示存在细胞学异常，细胞学异常比例为18.3%，细胞学异常者包括ascus16例、lsil12例、hsil4例。

2.2 hc2法和多重pcr法检测结果多重pcr检测结果显示，137例受检妇女为阴性，38例为阳性，检测阳性率为21.74%（38/175）。nilm组的13种hr-hpv阳性率为7.70%（11/143），低于宫颈细胞异常组（包括ascus、lsil和hsil组）的阳性率84.38%（27/32），差异有统计学意义（p<0.05）。hc2法检测结果显示，135例受检妇女为阴性，40例为阳性，检测阳性率为22.86%（40/175）。nilm组的13种hr-hpv阳性率为9.1%（13/143），低于宫颈细胞异常组（包括ascus、lsil和hsil组）的阳性率84.38%（27/32），差异有统计学意义（p<0.05）。两种检测方法相比结果差异无统计学意义，见表1。

2.3 hc2法和多重pcr法检测结果一致性比较以hc2法结果为参照标准，根据诊断试验评价四格表（表2），计算多重pcr检测hpv dna的敏感性、特异度、准确性、阳性预测值、阴性预测值分别为87.5%、97.8%、95.4%、92.1%、96.4%，具有较高的诊断价值。并且两种方法通过一致性检验，kappa值为0.868，一致性强。

3 讨论

通过检测发现，hpv感染率在nilm组明显低于在宫颈细胞异常组。说明hpv的感染与宫颈的病变有明显的相关性。但是cin各组间比较无显著性差异，表明多重pcr法和hc2法检测hr-hpv病毒载量与宫颈病变严重程度无关。此研究结果与有关文献报道存在差别[1]，可能与研究对象的区域性等因素有关。多重pcr与hc2法