大肠杆菌发酵生产L_色氨酸过程中的质粒稳定性

发酵科技通讯第39卷

L-色氨酸(Tryptophan)的化学名称为α-氨基-β-吲哚基丙酸，是人体和动物生命活动中八种必需的氨基酸之一，对人和动物的生长发育、新陈代谢起着重要的作用，被称为第二必需氨基酸，广泛应用于医药、食品和饲料等方面[1]。大肠杆菌发酵生产L-色氨酸，生产菌体生长快、生产周期短，易实现高密度培养，对用于生产的工程菌进行质粒稳定性的考察是非常必要的，因为携带重组质粒的工程菌在繁殖过程中往往会出现质粒丢失现象，从而影响外源基因产物的表达[2]。

1材料与方法

1．1菌种

Escherichia coli TRTH07-09，天津科技大学代谢工程研究室保藏菌株。

1．2培养基

1．2．1种子培养基(g/L)

蔗糖40，酵母浸出粉7．5，(NH4)2SO24，柠檬酸钠1．5，MgSO4·7H2O5KH2PO40．7，FeSO4·7H2O3mg，V B124mg，四环素50mg，微量元素2ml

1．2．2发酵培养基(g/L)

蔗糖70，酵母浸出粉4，(NH4)2SO43，柠檬酸1，柠檬酸钠1，MgSO4·7H2O3，KH2PO41．5，FeSO4·7H2O150mg，微量元素4ml

1．3培养方法

1．3．1种子培养：

吸取适量无菌生理盐水于5支活化斜面中，将所有菌悬液全部接入5L种子罐中，搅拌转速300r~700r／min，通过自动流加氨水控制pH在7．0，培养温度32℃。

1．3．2发酵培养：

按10％接种量将种子液接入5L发酵罐中；初始通风量2L／min；搅拌转速500r～800r／min通过自动流加氨水控制pH在7．0；培养温度32℃：以泡敌消泡；发酵到一定时间将800g／L葡萄糖溶液连续流加入培养基中，流加方式是使发酵罐中葡萄糖的浓度值不超过15g／L。

1．4质粒缺失率的检测

1．4．1平板稀释计数法：

将单菌落纯化的菌种转接至100ml液体选择性培养基中，摇瓶培养12h后以1％的接种量转入100ml液体非选择性培养基，开始连续摇瓶培养试验。每12h转种一次，接种量为1％。取样进行平板稀释检测质粒的缺失程度。检测时，取菌液lml用无菌水逐级稀释，取三个合适的梯度，分别涂在固体选择性培养基和非选择性培养基平板上，每个处理三个重复。倒置在37℃培养箱中培养24h，计算各皿中的菌落数。由于缺失质粒的菌在含有四环素的培养基上不能生长，因此，将选择性培养基中的菌落数与非选择性培养基中菌落数进行比较，即可计算出质粒的缺失率。

1．4．2平板点种法：

选择几个培养时间，随机挑取在非选择性培养基上生长的菌落，分别点种在对应的选择性培

大肠杆菌发酵生产L-色氨酸过程中的质粒稳定性

赵春光程立坤徐庆阳谢希贤陈宁

（天津科技大学生物工程学院天津300457）

摘要：研究L-色氨酸生产菌Escherichia coli TRTH07-09的质粒稳定性，在培养过程中考察了选择压力、温度、溶氧及酵母抽提物等因素对质粒稳定性的影响。结果表明该菌具有较好的结构稳定性和分裂不稳定性，在无选择压力和操作条件控制不当的情况下，质粒有一定程度的丢失。

关键词：L-色氨酸发酵质粒稳定性

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发酵科技通讯

第39卷第1期2010年1月

四环素浓度μg /ml

OD 660075.02078.65076.7100

75.5

15.488.617.295.719.510019.6

100

L-色氨酸

g/l 带质粒菌分数%

溶氧%

OD 660L-色氨酸g/L

带质粒菌分数%

153.8 6.4784.5558.610.7295.61075.515.3910020

77.8

18.80

100

图1温度对质粒稳定性的影响

养基和非选择性培养基平板上，观察两种平板中菌体生长情况，计算两种平板上生长的菌数比例，与平板稀释计数法计算的比率进行比较，验证质粒的缺失率[3]。

1．5分析方法

1．5．1菌体生长：吸取样品菌液，用蒸馏水稀释一定倍数，以蒸馏水作为空白对照，采用752分光光度计于1cm 光程比色皿中测定OD 660nm ，然后乘以

稀释倍数计算菌浓。

1．5．2蔗糖浓度测定：采用葸酮硫酸法[4]。1．5．3葡萄糖浓度测定：采用SBA-40C(山东科学

院生物研究所)生物传感仪测定。

1．5．4

L-色氨酸及副产氨基酸含量测定：采用高

效液相分析系统测定[5]。

2结果与讨论

2．1选择压力对质粒稳定性影响

从遗传学角度，施加选择压力是选择某些生

长条件使得只有那些具有一定遗传特性的细胞才能够生长，在利用工程菌进行发酵生产时，采取施加选择压力来消除重组质粒的分配性不稳定，以提高菌体纯度和发酵产率[6-7]。在种子培养基中分别添加0、20、50、100μg ／mL 的四环素，发酵36h 时，采用平板稀释计数法考察质粒的缺失情况。试验结果如表1所示。

表1

四环素对质粒稳定性影响

由表1可知，当种子培养基无抗生素选择性压力时，质粒有一定程度的丢失，当四环素浓度大于50μg ／ml 时，质粒基本不丢失。L-色氨酸生产菌丢失质粒成为宿主菌，在无选择压力的培养条件下，宿主菌由于没有额外的代谢负担，相对于生产菌具有生长优势，随着传代次数的增加最终可取代生产菌而成为优势菌，从而造成发酵的失败。四环素浓度过高，也会抑制正常菌体的生长，导致种子培养周期延长，但对发酵影响不大。

2．2温度对质粒稳定性影响

微生物的生长和产物的合成都是在各种酶催化下进行的，温度是保证酶活性的重要条件[8]。因此，各种微生物在一定的条件下都有一个最适的生长温度范围，温度过高或过低都会影响微生物的比生长速率，Seo 和Bailey 发现生长速率增大，质粒的拷贝数下降，认为高比生长速率下，质粒的复制速率跟不上细胞分裂的速率[9]。发酵过程分别采用不同的温度28℃、30℃、33℃、36℃下发酵

36h 时，采用平板点种法考察质粒的缺失情况。试验结果如图1所示。

由图1可知，36℃时虽然获得最高的菌体量，但是产酸却不是最高的，质粒丢失比较严重。说明温度升高使生产菌比生长速率过大从而增加了质粒分配不稳定性。28℃时质粒基本不丢失但是过低的温度使菌体生长缓慢产酸下降。因此需要选择一个适当的温度(如33℃)使菌体生长速率与质粒稳定性之间达到平衡。

2．3溶氧对质粒稳定性影响

分别维持1％、5％、10％、20％的溶氧，发酵

36h ，采用平板稀释计数法考察质粒的缺失情况。

试验结果如表2所示。

表2

溶氧对质粒稳定性影响

由表2可知，发酵过程中维持1％溶氧，质粒缺失现象严重，对L-色氨酸的产生影响很大，随着溶氧的逐步提高，质粒的缺失现象也逐渐减少，当溶氧大于10％时，质粒基本不丢失。携带质粒的基因工程菌相对于野生菌增加了额外的代谢负担，对氧需求量较大，发酵液中必须有足够浓度的

O D 660

带质粒菌分数％

L -色氯酸g /l

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