以端粒酶活性为作用靶点筛选抗肿瘤药的一种快速简易方法

中　国　药　科　大　学　学　报
Journal of China Pharmaceutical University　1999,30(1):54～57
以端粒酶活性为作用靶点筛选抗肿瘤药的
一种快速简易方法
崔景荣　徐　波　李　敏　叶　颖　吴　军　张国青　冉福香
(北京医科大学药物及仿生药物国家重点实验室药理组,北京100083)
摘　要　利用PCR扩增端粒重复序列,通过电泳和银染色测定扩增产物,以电泳胶中6bp梯状条带确定端粒酶活性。

温度30℃,反应时间为60min时可以使酶提液与未知化合物作用后还保持着酶的活性。

从电泳的上样量及不同浓度细胞酶提液的结果表明,最低上样量10μl和细胞酶提液0.5μg时,能得到清晰6bp的梯状条带。

RNase0.05μg对端粒酶活性显示抑制作用,而对T aq DNA酶没有影响。

关键词　端粒酶活性;人肿瘤细胞株;PCR扩增;药物筛选
端粒是染色体特殊结构,这种结构对于染色体的完整和稳定起着保护的作用[1]。

在哺乳动物中,端粒是由短DNA重复序列组成,即(TTAGGG)n。

由于末端复制问题造成端粒末端序列丢失,使得端粒长度缩短[2],而端粒酶可以维持端粒末端的长度。

端粒酶是一种核糖核蛋白返转录酶,由RNA和蛋白质组成,端粒酶可以以自身的RNA为模板合成端粒末端[3,4]。

已发现在正常的体细胞和良性肿瘤组织中端粒酶活性是阴性(除了生殖细胞外);而在人体恶性肿瘤组织和人的肿瘤细胞株中都表达了很高的活性[5～7]。

因此,认为端粒酶与恶性肿瘤的发生发展有着密切的关系,有可能成为肿瘤治疗的靶点[8]。

Kim等人已建立了灵敏的测定端粒酶活性的方法,即端粒重复扩增法(telomeric repeat amplification protocol,简称TRAP)[6]。

本文研究的目的是在Kim等人的方法基础上加以修改,建立简便、快速和非放射性的方法,以适用于大量筛选寻找端粒酶抑制剂。

1　材料和方法
1.1　主要试剂及仪器
TS引物[5′-AATCCGTCGAGCAGAGT T-3′]和CX引物[5′(CCCTTA)3CCCTAA-3′]均由上海生物工程公司-加拿大Sangon上海分公司合成。

Tag DNA多聚酶及PCR扩增反应液均购于北京鼎国生物技术发展中心。

三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)购自上海生工生物工程公司。

DNA扩增系统A(Cat.No.K3600)购自华美生物工程公司北京分公司。

丙烯酰胺和硝酸银分别由Merck-schuchardt和北京化工厂生产。

其它试剂均为分析纯,购自天象人生物工程有限责任公司。

Gene Am p PCR system9600型DNA扩增仪由Perkin-Elmer公司生产。

Biofuge28RS型冷冻离心机为Heraeus产品。

DF-D型恒压恒流电泳仪由北京东方仪器厂生产。

1.2　细胞培养
人肿瘤细胞株(Bel-7402、Hela)均由本室细胞库提供。

细胞均在5%CO2,37℃培养箱中培养,培养液为RPM I1640(GIBCO产品),其中含小牛血清10%,青霉素100IU/ml和链霉素100μg/ml。

1.3　人肿瘤细胞端粒酶的提取
取生长状态好的肿瘤细胞1×107/ml,经离心、洗涤后,加入冷的裂解液200μl[100mmol/L Tris-HCl(pH7.5);1mmol/L M gCl2;1mmol/L EGTA;0.1mmol/L苯甲基磺酰氟(phenyl methy lsulfonyl fluo ride);5m mol/Lβ-巯基乙醇(β-mercaptoeth-anol);0.5%CHAPS;10%甘油(glyc-erol)],在冰浴中放置30min,然后16000×g离
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收稿日期　1998-09-25　本课题由天然药物及仿生药物国家重点实验室基金资助
心,4℃,20min,取上清液按Brodfo rd方法[9]测定细胞裂解液蛋白量。

分装,放置-80℃保存。

1.4　RNase与端粒酶的反应
取细胞酶提液1μl加入不同浓度(终浓度为
1,0.5,0.05,0.01,0.005μg)的RNase,在37℃条件下反应20min。

然后加入PC R扩增系统中。

1.5　端粒酶活性测定(TRAP法)
参照Kim等人[6]方法,但有部分改进。

①端粒酶产物的扩增:取细胞酶提液1μl分别加入TS 引物0.36μmol/L,dNTP50μmol,Taq DNA多聚酶1I U,CX引物0.28μmol/L,Mg2+1.5m mol,在25μl反应液中进行PCR扩增。

扩增程序为在30℃反应30min,72℃30s,然后在94℃变性30s, 55℃退火30s,72℃延伸30s,进行30个循环。

②聚丙烯酰胺凝胶电泳分析扩增产物:用12%丙烯酰胺灌胶,胶聚合后,取扩增产物1025μl加入加样孔中,以180V的电压进行电泳2h左右。

③银染显色:用10%乙醇和0.5%冰醋酸固定聚丙烯凝胶35min,然后加入硝酸银溶液(最终浓度为0.2%),在37℃水浴上振荡染5min,用超纯水洗涤三次。

再加入显色液(30%氢氧化钠和0.1%甲醛)振荡直至DNA条带出现,一般为20min。

最后将显色凝胶移至固定液中固定5min。

普通光源照像。

④结果判断:以6bp梯状条带为阳性,即以PCR扩增产物间接反映端粒酶活性。

本文结果均重复23次。

1.6　RNA酶对Taq酶活性的影响
方法参见DNA扩增系统A试剂盒说明书,在反应体系中加入不同浓度的RNase。

2　结　果
2.1　不同温度对端粒酶活性的影响
结果如图1所示,细胞酶提液与TS引物等PCR反应系统分别在37℃,30℃,25℃和室温下反应30min,只有在30℃情况下及可见明显的阳性梯状条带,而在其它温度时及细胞酶提液与RNase 反应20min后,均未见阳性条带。

2.2　端粒酶提取液热稳定性试验
从图2结果可以看出,细胞酶提液在30℃条件下保温不同时间时,AF道均可见清晰的条带,随保温时间延长条带减少并变浅。

2
.3　不同反应时间对端粒酶活性的影响
在30℃保温条件下,细胞酶提液与TS引物等PCR反应物作用25min时,如图3所示,可见阳性梯状条带,而在其它反应时间时,梯状条带减少变浅,反应1min再PCR扩增未见阳性条带。

lines A,C,E,G:25℃,37℃,30℃and room temperature(ex-tract from Bel-7402tumor cells)
Fig1.Effect of different temperature on the telomerase activity
A line:10min;
B line:20min;
C line:30min;
D line:40min;
E l ine:50min;
F line:60min;
G line:90min;
H line:120min Fig2.Effect of different heat p res ervation on the tel omerase activi-ty
2.4　不同量细胞酶提液的端粒酶活性
结果如图4所示,细胞酶提液0.5,1.0和2.0μg与PC R反应体系作用后,可见阳性6bp梯状条带,而其余浓度的细胞酶提液和经RNase预处理的细胞酶提液均没有阳性条带。

2.5　PCR扩增产物的不同上样量电泳结果
从图5结果可以看出,在不同上样量中均可见到阳性的梯状条带,其中以上样量20μl的电泳条带最为清晰。

随着上样量减少,梯状条带逐渐变浅,宽度变窄,说明PC R扩增产物量减少。

2.6　RNase对Taq DNA酶和端粒酶的影响
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1期 崔景荣等:以端粒酶活性为作用靶点筛选抗肿瘤药的一种快速简易方法
A line:35min;
B line:25min;
C line:20min;
D l ine:10min;
E line:5min;
F l ine:3min;
G l ine:1min
Fig3.Effect of varying reaction time on the tel omeras e
activity
A line:l ysis buffer;
B l ine:telomerase extract from Bel-7402cells +RNase;C,D,E,F,G,H,I line:telomerase extract from Bel-7402cells0.005μg,0.01μg,0.05μg,0.1μg,0.5μg,1μg,2μg
Fig4.Tel omeras e activity results for different telomerase extract of quantities of cell
从图6中可以看到,第A,C和D道均未见PCR扩增DNA条带,而在第B,E,F和G道,可见相同的(100bp)DNA条带,由此可以看出,在高浓度时RNase对Taq DNA酶活性有抑制作用,影响了DNA扩增。

在第H道中可见阳性6bp梯状条带,而在第I道中没有显示阳性条带,说明RNase
抑制了端粒酶活性。

A line:5μl;
B line:10μl;
C line:15μl;
D line:20μl;
E l ine: 25μl
Fig5.T he electrophoresis results for various quantities of PC R products
A line:DNA kit1(dNTP,Taq DNA polymeras e,primer);
B l ine: DNA kit2(DNA template,dNTP,Taq pol ymerase,primer);
C line:DNA kit2+RNase0.5μg;
D l ine.DNA kit2+RNase0.1μg;
E line:DNA kit2+RNase0.05μg;
F line DNA kit2+RNas e 0.01μg;
G l ine:DNA kit2+RNase0.005μg;
H line,tel omeras e extract of Hela cell;
I line:telomerase extract of Hela cell+RNas e 0.05μg
Fig6.Effect of RNas e on Taq DNA polymeras e and telomerase
3　讨　论
恶性肿瘤治疗的理想靶点应该是寻找到一种对肿瘤细胞生长所必须,但又不存在于正常细胞的物质。

端粒酶就是一种在许多肿瘤组织中处于高表达活性[8,10],而在正常组织中却没有酶活性表达的特殊核糖核蛋白物质(除生殖和造血干细胞外)。

它在维持肿瘤细胞的高度增殖时,对端粒的缩短起着重要的作用,从而提示端粒酶可能在恶性肿瘤组织中是一个标志。

56 中国药科大学学报 30卷
本研究应用TRAP -银盐染色方法是对Kim 等人方法进行了改进,目的是适用于大量筛选寻找端粒酶抑制剂。

实验结果表明,温度为30℃,反应时间为60min 时是可以使酶提液与未知化合物作用后还保持着酶的活性。

另外,从电泳的上样量及不同浓度细胞酶提液的结果得知,最低上样量10μl 和细胞酶提液0.5μg 时,就能得到清晰的6bp 的梯状条带,从而使实验中所用的试剂量减少,节省了实验费用。

在TRAP 法反应体系中有两种酶存在,即Taq DNA 酶和端粒酶,寻找端粒酶抑制剂时,为了排除未知化合物对Taq DNA 酶的作用,本文探讨了不同浓度的RNase 对两种酶的作用。

结果显示,用0.05μg RNase 预处理细胞酶提液后,没有出现6bp 梯状条带,而用相同的RNase 浓度时,对Taq DNA 酶活性并没有影响,说明RNase 造成的梯状条带消失是由于抑制了端粒酶活性而引起的。

药物筛选的原则应该是方法灵敏、简便、快速、实验费用低。

本文采用的TRAP -银盐染色法与TRAP -放射自显影法比较,除了具有特异性和灵敏性外,实验周期缩短,反应体系中的各种试剂量减少,使得实验费用降低,无放射性污染。

因此,认为TRAP 方法改进后适用于药物筛选。

除此之外,也适用于端粒酶作用机制,表达调控及端粒酶与恶性肿瘤关系等方面的研究。

虽然TRAP -银盐染色法有许多优点,对于药物作用的研究,还有不足之处。

也就是说,该方法
只能作为定性评价,不能定量,因此很难评价一个药物对酶活性作用的强弱。

目前可用TRAP -ELISA 法定量测定端粒酶活性,但该方法实验费用较高,不能用于大量筛选。

对建立适用于药物筛选的定量方法还有待进一步研究探讨。

参考文献
1　Blackburn EH .S tructure and function of telomere .Nature ,
1991,350:569
2　M oyzis RK ,Buckingham JM ,Gram LS .et a l .A highly con -s erved repeatitive DNA sequence ,(TTAGGG )present at the tel omeres of human chromosomes .Proc Natl Acad Sci US A ,1988,85:6622
3　Greider CW ,Blackburn EH .A telomeric sequence in the RNA of
tetrahymena telomerase required for telomeric repeat s ynthesis .Nature ,1989,337:331
4　Joachim Lingner ,Timothy RH ,Andrej S ,et al .Revers e tran -s criptase motifs in the catalytic subunit of telomerase .Scienc e ,1977,276(25):561
5　Counter CM ,Hirte HW ,Bacchetti S ,et al .Telomerase activity
in human ovarian carcinoma .Proc Na tl Acad S ci US A ,1994,91:2900
6　Kim NW ,Piatyszek M A ,Prow se KR ,et al .Specific association
of human telomerase activity with immortal cells in cancer .Sci -ence ,1994,266:2011
7　M orin GB .Is telomerase a univers al cancer target ?J Natl Cancer
Ins t ,1995,87:859
8　Hiyamak H .Tel omeras e activity in samll cell and non small cell
lung cancer .J Natl Cancer Inst ,1995,87(12):895
9　Bradford M M .A rapid and sensitive method for the quantition of
microgram quantities of protein us ing the principle of protein -dye binding .Anal Biochem ,1976,72:248
10Hiyama E ,Yokoyama T ,Tatsumoto N ,et al .Tel omeras e activity
in gastric cancer .Canc er Res ,1995,55(15):3258
A Quickly and Simplified Method for Screening Anticancer Drug in
Telomerase Activity as a Target
Cui Jingrong ,Xu Po ,Li M in ,Ye Ying ,Wu Jun ,Zhang G uoqing ,Ran Fuxiang
National Res earch Laboratorie s of Natural and Biomimetic Drugs B eijing M edic al University ,Beijing 100083A bstract Telomerase activity w as measured by the polymerase chain reaction (PCR )-based telomeric repeat amplification protocol (T RAP ).For analysis of the TRAP assay ,the PC R products were separated by the gel electrophoresis .The 6bp DNA ladder w as showed by the silver staining .Telomerase activity w as observed at the temperature of 30℃and in reaction time of 60min .The results obtained varying PCR products quantities and telomerase extract from cell show ed that distinct 6bp DNA ladder could be got at 10μl PCR product quan -tity and 0.5μg telomerase extract from tumor cell .Telomerase activity w as inhibited at the co ncentration of 0.05μg RNase ,and no effect occurred for the Taq DNA poly merase .Key words Telomerase activity ;Human tumor cell line ;PCR amplification ;Screerning durg
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