放射性同位素的应用

放射性同位素在药物的吸收、分布、代谢与排泄研究中的应用
I. 基本原理和检测手段
顾哲明1,方忻平2,冯浩2,薛丽2, 吴晋1,2
1XenoBiotic Laboratories, Inc., Plainsboro, NJ 08536, U.S.A. (XBL)
2南京美新诺医药科技有限公司，南京，江苏 210038, 中国 (XBL-China)
摘要
在新药研发过程中，放射性同位素标记技术是非常有用的工具。

低能量的放射性同位素(如氢-3和碳-14) 标记化合物在新药安全性评价中特别重要，尤其是应用在药物临床前动物实验(如大鼠、小鼠、狗和猴)和临床受试者体内的吸收、分布、代谢和排泄研究，以及在不同动物或动物与人之间的结果比较研究。

通常测定血浆、尿液、粪便和/或胆汁中的放射性代谢谱就能够准确的获得药物的代谢谱，包括不同代谢产物的比较。

恰当地处理低能量放射性同位素标记化合物，包括检测、分析、个人防护及废物处理，对于整个研究的成败至关重要。

本篇综述包含两个专题，第一专题将讨论放射性同位素标记化合物应用于新药研发的基本原理，以及氢-3和碳-14标记药物的标准检测方法。

关键词：吸收；分布；排泄；代谢；放射性同位素
1. 简介
在过去的几十年中，放射性同位素在研究新化合物的吸收、分布、代谢和排泄(ADME)特性中发挥着至关重要的作用。

由于放射性同位素具有较低的天然丰度值，因此使用放射性同位素具有高特异性和易检测性的特点。

此独特的技术也使得检测更容易、方法可靠并且灵敏度高。

放射性同位素已经逐步被证实是新药吸收、分布、代谢与排泄研究中必不可少的工具，在美国、欧洲和日本的医药产业和研发机构中被广泛采用。

大多数用于申请美国食品药品安全监督管理局(FDA) 有关新药注册（NDA）中药物安全性评价研究时，都采用放射性同位素标记化合物给药后在动物及人体内的药代动力学数据。

有关放射性同位素的基本知识和应用信息可以在很多期刊文献中查到。

本综述包含两个专题，将分别讨论和介绍放射性同位素的基本原理及其在药物代谢研究中的应用。

第一专题：正如标题所述主要围绕基本原理及其检测手段进行介绍。

2. 放射性同位素的基本知识
2.1 稳定及不稳定性同位素
一个原子是由带正电的“质子”、不带电的“中子”及带负电的“电子”组成(除了氢原子，其不包含中子以外)。

原子是根据原子核中的质子和中子数分类，质子数决定元素种类, 中子数决定元素的同位素。

同位素是指一类具有相同的质子数，但是包含不同的中子数的相同的化学元素。

因此，同位素之间的区别在于不同的质量数，而不是原子序数[1]。

例如：碳-12(12C)，碳-13(13C) 和碳-14(14C)是三种碳元素的同位素，质量数分别为12、13 和14，而碳元素的原子序数为6，因此这三种碳元素的中子数分别为12−6 = 6, 13−6 = 7, 和14–6 = 8。

稳定性同位素是一种不衰变的化学同位素，因此不具有放射性。

不稳定性同位素其原子具有不稳定原子核，并且原子核通过热能、光子或者放射性衰变等形式进行能量衰退。

如果不稳定性同位素是以放射性衰变的形式进行能量衰退，化学家和物理学家通常将此同位素称为放射性同位素。

2.2 放射性衰变及单位
不稳定性同位素会进行放射性衰变，通过发出电离粒子和辐射释放能量，从而最终形成一种不同类型的原子。

例如：一个碳-14原子通过释放辐射能量后转化成了一个氮-14原子。

放射性活度的国际单位(SI) 是贝克(Bq)。

一个贝克定义为一秒钟有一个原子发生放射性衰变量。

如同所有的国际单位，贝克前面也能够添加前缀，其通常使用的复合单位包含：千贝克(kBq，103Bq), 兆贝克（MBq, 106 Bq）, 和千兆贝克（GBq, 109 Bq）。

另一个放射性活度单位是居里 (Ci), 其最初定义为相等于1克纯镭的镭射气(氡-222) 的量。

一个居里等于3.7 ×1010贝克。

目前国际单位中很少使用居里，但美国还是主要使用居里单位。

放射性活度单位通常还会使用每秒钟衰变数和每分钟衰变数 (dps/dpm)。

2.3 放射性标记化合物的比活度
比活度 (S A) 是一定量含放射性同位素在某一定的时间内的衰变数。

在药物代谢研究中，比活度通常表示为千兆贝克/毫摩尔（GBq/mM）或者每分钟衰变数/微克（dpm/µg）。

一个完全单一碳-14标记的化合物具有2.313千兆贝克/毫摩尔或者62.5毫居里/毫摩尔(1毫居里= 3.7×107贝克或2.22 x 109 dpm)。

2.4 天然本底（背景）辐射
虽然处于非常低的水平，本底辐射仍然存在于自然环境中(包括人体)，并且广泛从多种天然和人造来源中发射出来。

天然本底辐射有两个主要来源：宇宙射线和地球天然物质。

不同地理位置的天然本底辐射水平不同，在某些地理位置本底辐射水平会显著地高于平均水平。

放射性物质是普遍存在的，它不仅存在于天然的土壤、岩石、水、空气和植物体中，而且构成人体的一些基本元素（如钾、氢和碳）也包含放射性同位素。

人体平均包含30毫克钾-40 (40K) 和大约10纳克碳-14 (14C) 。

钾-40的衰变数为4千贝克，与碳-14的衰变数1.2千贝克相比，钾元素就原子数衰变方面是最大的辐射源。

香蕉是一种富含钾的营养丰富的水果，其中所包含钾-40能够被仪器检测到。

钾-40衰变产生的β-粒子能量约高于与碳-14衰变产生能量的10倍。

虽然钾原子不是构成DNA的组成成分，然而，约一半细胞中的遗传基因都包含一个碳-14原子，每秒钟DNA中将一个碳-14原子转化成一个氮-14原子所发生的衰变次数约50次（50贝克）[2] 。

地面上的核爆炸将会引起大面积的放射性污染。

老煤矿厂如果没有有效地采取粉尘净化设施将会成为最大的人造的放射性污染源。

天然的与人为的放射性污染源具有相同的性质和危害，这些放射性物质将散布到环境中，并且最终进入人体。

平均每人每年受照剂量约为3.6毫希，其中80%来自天然本底辐射[3] ，剩余20%来源于人造辐射源，诸如：医疗X-射线，类似于烟雾探测器的工业放射源，以及一小部分来源于核武器实验。

美国和相关国际组织都要求持辐射安全许可证的机构控制公众的个人照射剂量限值每年不应超过1毫希(mSv，注：当量剂量和有效剂量的单位都是J·Kg-1, 专用名称为希，符号为Sv，工作中常用毫希和微希，历史上曾用过雷姆作为当量剂量的专用单位，1rem=10-2Sv) ，以及控制辐射工作人员的职业照射剂量每年不应超过50毫希，5年不应超过100毫希。

2.4 电离辐射及半衰期 (t1/2)
放射性衰变会引起以下三种电离辐射：
2.4.1 Alpha (α) 辐射是由包含较大原子核衰变的引发的，所发射的α粒子(如氦原子核，He2+) 包含2个中子和2个质子，具有相对较高电荷，可以造成严重电子解离，如果摄取吸入将会对人体造
成极大的损伤。

然而，由于α粒子具有较高质量，故其能量较低，穿透距离短；一般能够被一张纸(或者皮肤)阻挡。

2.4.2 Beta-minus (β-)辐射会包含一个具有能量的负电子，它比α粒子难电离，但较γ粒子易电离。

这些负电子通常能够被一些几厘米厚度的金属阻挡。

当原子核中一个中子衰变成一个质子时，会放射出β粒子及反中微子。

2.4.3 Beta-plus (β+)辐射会引起正电子放射，因为正电子是反物质，他们会消减附近任何的物质，并且释放出γ光子（例如：γ-射线）。

因此，尽管释放出了γ光子，(β+)辐射不会造成任何直接的危险。

2.4.4 Gamma (γ)辐射由一些频率高于1019赫兹的光子组成。

能量过剩的原子核在释放出α-辐射或者β-辐射后，会发生γ-辐射以除去过剩的能量，它的穿透力是最强的。

2.4.5 放射性同位素的半衰期(t1/2) 是指一定量的放射性同位素物质所含放射量衰减一半所需要的时间。

例如：3H 和14C 的半衰期分别为12.26年和5730年。

3. 低能量的放射性同位素在药物代谢(ADME)研究中的应用及其对人类和自然环境的安全性
放射性同位素氢-3（3H；亦称氚）和碳-14（14C）被广泛应用于药物吸收、分布、代谢和排泄的研究。

氢-3（3H）和碳-14（14C）在进行衰变的时候，放射出低能量β射线粒子，具有非常低的穿透能量。

此外，药物代谢研究中使用的放射性活度总量很低。

通常一只大鼠和一位临床实验者给药的放射性活度水平分别仅在0.56-1.11 兆贝克和3.7 兆贝克（20-30 微居里和100 微居里) 。

在如此低的放射性水平下，一张普通的白纸或者人体完好无损的皮肤就能够有效的阻挡绝大多数生物样品中发射出来的电离辐射（图1）。

因此，如果操作人员遵循实验室相关安全规程，那么应用到药物代谢研究中的放射性物质对人体健康不会构成危害。

- (3
图1 一张普通的白纸（左）或者实验室手套能够有效的阻挡氢-3和碳-14放射出β射线粒子氢-3（3H）和碳-14（14C）的半衰期相对较长，尤其是碳-14（14C）。

假设，如果1贝克的
碳-14-标记的化合物泄露到实验台上，那么需要等5730年后，其放射性活度才会衰减到0.5贝克。

因此，必须严格的遵循实验室安全操作规程，避免污染环境，在实验室内，所有操作人员处理放射性样品时都必须衣着实验服、戴手套。

所有允许进行放射性同位素操作的实验区都应该配备一个表面污染检测仪，用以检测可能会发生的泄露，除此之外，同样需要进行常规和非常规的擦拭实验，以监测实验区的污染状况。

放射性废物与普通废物需要分类收集并且由专业的危废机构进行处理。

所有实验区的放射性废液在排放到城市公共污水管网之前，应该首先通过内部废水净化体系进行处理（图2）。

图2 南京美新诺配备的含放射性废水活性炭净化系统
4. 低能量β-粒子的放射性检测仪器
早在半个世纪以前，就已经开始采用液体和固体两种闪烁计数方法检测生物样品中放射性活度。

随着计算机技术的进步，检测β-粒子变得相对更简单和方便。

下面将列举目前在药物代谢研究中常用检测β-粒子的放射性检测光谱仪及检测器.
4.1 盖氏计数器
盖氏计数器，也称作便携式或者气相放射性检测仪，其用于测定电离辐射(通常用于测定β-粒子和γ-射线)。

尽管盖氏计数器非常有用、价格实惠且耐用，它仅仅能够检测到辐射的存在及强弱 (粒子的频率，与能量相对应)。

实验室通常使用盖氏计数器（图3）检测表面污染。

图3 南京美新诺配备的盖氏计数器
4.2 液体闪烁计数仪
液体闪烁计数仪是药物代谢实验室一种基本的检测工具，它可以检测放射性同位素β-辐射的放射性活度值。

首先，将检测样品溶解或悬浮于闪烁液中，闪烁液包含芳香烃类溶剂和其他少量称为荧光剂的添加试剂。

放射性样品释放出β- 粒子并且将能量转移给溶剂分子，依次再传递给荧光剂分子。

被激活的荧光剂分子通过释放光子分散能量。

按照此方式，在理想的情况下，每个β-辐射都将产生一个脉冲光。

因此，该仪器称为液体闪烁计数仪。

药物代谢实验室通常使用PerkinElmer Tri-Carb 系列（图4）和Beckman LS 系列液体闪烁计数仪检测低能量的β-粒子。

对于固体样品(如动物组织、尸体、植物体、土壤等) ，必须将其溶解或者使用生物样品氧化燃烧仪，将其燃烧转化为14CO2和/或者3H2O，然后使用液体闪烁计数仪测定。

氧化燃烧仪利用高温、氧气以及氧化催化剂，将固体有机物质有效、高效地完全转化成14CO2和/或者3H2O。

下图为常用的生物样品氧化燃烧仪（图5）：
图4. 南京美新诺配备的PerkinElmer TriCarb液体闪烁计数仪(左)和Harvey生物样品氧化仪(右）
4.3 固体闪烁计数仪
固体闪烁技术是液体闪烁技术的一种替代技术。

使用此方法，含放射性同位素的液体样品能够直接分布到一种固体闪烁介质中，经过干燥除去挥发性溶剂后，利用闪烁计数定量测定所含少量非挥发性的放射性同位素样品，此外，还适用于酶抑制、细胞毒性，免疫测定、受体结合及各种代谢等研究。

药物代谢实验室常用固体闪烁计数仪包括PerkinElmer 生产的TopCount（图5）和MicroBeta2™ plate counters两种。

图5 南京美新诺配备的PerkinElmer TriCarb固体闪烁计数仪
4.4 高效液相色谱联用在线放射性同位素检测仪
在线放射性检测器是用来检测样品经过高效液相色谱仪分离后放射性标记化合物含量的一种检测仪，主要用于药物代谢研究中。

高效液相色谱联用在线放射性同位素检测技术在定性和定量生物样品中的代谢产物方面发挥举足轻重的作用。

药物代谢实验室常用在线放射性同位素检测仪包括液体检测池和固体检测池两种。

其中ν-ARC™ 动态放射性在线检测仪（图6）具有较高的液体检测灵敏度，最低检测限可达到10 DPM。

图6 南京美新诺配备的ν-ARC™ 动态放射性在线检测仪
4.5 荧光显影呈像技术
此技术是使用“荧光”化合物遇见放射性辐射会发射出可见光的原理检测放射性活度。

与传统的自显影技术相比，荧光显影呈像技术具有一些优势，但尤其重要的是在定性定量放射性同位素标记化合物及代谢产物在活体组织内分布和胎盘内转移方面，荧光显影呈像技术更加准确。

将含放射性动物组织切片放置于荧光显影呈像板上，荧光板能够吸收β-射线，从而激活荧光板上的分子，并且使分子保持激活的状态。

荧光板捕获的β-射线能量被释放出来，在用激光扫描荧光板时，可以被计算机化的检测器扑获，计算机将检测到的能量转化成图像。

药物代谢实验室通常会使用Fujifilm BAS 系列的荧光显影呈像仪。

下图为XBL-美国总部在使用的Fujifilm BAS-5000 荧光图像扫描仪（图7）进行大鼠口服碳-14标记化合物后全身放射性扫描结果。

此外，荧光显影呈像技术也可与薄层色谱技术联用，可以用来检测薄层色谱分离出来的放射性标记化合物，方便，快速，且灵敏。

图7 XBL配备的Fujifilm BAS-5000荧光图像扫描仪(左)和影像自显影技术(右)
5. 最近发展
在过去二十年的药物代谢研究中，传统的放射性同位素检测仪仍然属于的最灵敏的仪器，对于一般具有适当的比活度的14C-标记的化合物，最低检测限可以达到纳克级。

对于放射性同位素检测灵敏度的挑战来自于具有极高检测灵敏度的液相色谱联用质谱技术(LC/MS) 的广泛应用。

许多仪器供应商都付出极大地努力，力求通过降低仪器的信噪比（背景干扰）并增加检测器的灵敏度，如Perkin-Elmer Tri-Carb 3110 TR 型液体闪烁计数仪极大地降低了仪器的本底值，从而降低了样品的最低检出限。

液相色谱联用放射性动态在线检测仪(v ARC) 与其他同类产品相比，最低检测限降低了5倍。

固体闪烁计数仪结合24-, 96-, 和384-孔板技术(PerkinElmer's TopCount 和MicroBeta2™ 板计数仪)的应用革命性地改变了传统药物代谢指纹谱的研究程序，不仅降低本底值到1-2 dpm，而且大大提高研究效率。

加速器质谱(AMS)是检测放射性活度超灵敏的技术4,5。

几年前，当临床药物开发中采用微量给药时，加速器质谱作为一种分析工具被应用于药代动力学的研究中。

通常临床受试者只需给
于非常低的放射性剂量 (大约370贝克)，用以药物的物料平衡和代谢研究。

加速器质谱能够从大量相近的质量中分辨出稀有的同位素(例如：从12C中区分14C) ，比传统液体闪烁计数仪灵敏度增加109 倍。

[附注：本篇文章的原稿英文版已发表在：Gu ZM et al. Asian Journal of Pharmacodynamics and Pharmacokinetics 2010; 10(1):11-18]
参考文献
1. IUPAC /I03331.html.
2. /wiki/Isaac_Asimov Asimov, Isaac (1976). The Explosions Within Us.
Only A Trillion (Revised and updated ed.). New York: ACE books. pp. 37–39.
3. The Health Physics Society, the University of Michigan, Radiation and Us
(/~radinfo/introduction/radrus.htm)
4. Brown K, Dingley KH, Turteltaub KW. Accelerator mass spectrometry for biomedical research.
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