荧光原位杂交

荧光原位杂交
FISH的原理 FISH的原理
FISH的操作及应用 FISH的操作及应用
FISH的展望 FISH的展望
荧光原位杂交
FISH的原理 的原理
• FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针， 的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针， 的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针 按照碱基互补的原则， 按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸 进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。 进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由 于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排 分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排 列，因而可以将探针直接与染色体进行杂交从而将特 定的基因在染色体上定位。 定的基因在染色体上定位。 • 目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、 目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、 染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、 染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前 诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。。 诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。。
Байду номын сангаас光原位杂交
洗脱
此步骤有助于除去非特异性结合的探针，从而降低本底。 此步骤有助于除去非特异性结合的探针，从而降低本底。 温箱中取出， （1） 杂交次日，将标本从 ） 杂交次日，将标本从37 C温箱中取出，用刀片轻轻将盖玻 温箱中取出 片揭掉。 片揭掉。 的体积分数50 （2） 将已杂交的玻片标本放置于已预热 ～50 C的体积分数 ） 将已杂交的玻片标本放置于已预热42～ 的体积分数 甲酰胺/2× 中洗涤3次 每次5min。 ％甲酰胺 ×SSC中洗涤 次，每次 中洗涤 。 中洗涤3次 每次5min。 （3） 在已预热 ～50 C的1×SSC中洗涤 次，每次 ） 在已预热42～ × 中洗涤 。 中轻洗一下。 （4） 在室温下，将玻片标本于 ×SSC中轻洗一下。 ） 在室温下，将玻片标本于2× 中轻洗一下 （5） 取出玻片，自然干燥。 ） 取出玻片，自然干燥。 复染溶液（ 染液） （6） 取200µL复染溶液（PI/antifade或DAPI/antifade染液）滴 ） 复染溶液 或 染液 加在玻片标本上，盖上盖玻片。 加在玻片标本上，盖上盖玻片。
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• FISH技术包括下列几个步骤： 技术包括下列几个步骤
• • • • • • • 1）探针的制备和标记 ） 2）探针及标本变性 ） 3）杂交 ） 4）洗脱 ） 5）杂交信号的放大（适用于使用生物素标记的探针） ）杂交信号的放大（适用于使用生物素标记的探针） 6）封片 ） 7）荧光显微镜观察 ）荧光显微镜观察FISH结果 结果
荧光原位杂交
• 荧光原位杂交 荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH) • 荧光原位杂交是在20世纪 年代末在放射性原位杂交技术的基础上 荧光原位杂交是在 世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基础上 世纪 发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术,以荧光标记取代同位素 发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术 以荧光标记取代同位素 标记而形成的一种新的原位杂交方法,探针首先与某种介导分子 标记而形成的一种新的原位杂交方法 探针首先与某种介导分子 (reporter molecule)结合 杂交后再通过免疫细胞化学过程连接上荧 结合,杂交后再通过免疫细胞化学过程连接上荧 结合 光染料. 光染料
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杂交
• 将已变性或预退火的 将已变性或预退火的DNA探针 探针10µL 滴于已 探针 变性并脱水的玻片标本上，盖上18× 盖玻 变性并脱水的玻片标本上，盖上 ×18盖玻 封片， 片，用Parafilm封片，置于潮湿暗盒中 oC 封片 置于潮湿暗盒中37 杂交过夜（ 杂交过夜（约15～17h）。 ～ ）。 • 由于杂交液较少，而且杂交温度较高，持续 由于杂交液较少，而且杂交温度较高， 时间又长，因此为了保持标本的湿润状态， 时间又长，因此为了保持标本的湿润状态， 此过程在湿盒中进行。 此过程在湿盒中进行。
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探针的制备和标记
• 探针是一段带有荧光色素或（半）抗原的核苷酸序列。 探针是一段带有荧光色素或（ 抗原的核苷酸序列。 其长度介于15至数千个核苷酸之间 但以250~650个核 至数千个核苷酸之间， 其长度介于 至数千个核苷酸之间，但以 个核 苷酸杂交效果最好 • 探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。 探针的荧光素标记可以采用直接 间接标记的方法 直接和 的方法。 间接标记是采用生物素标记 是采用生物素标记DNA探针，杂交之后用藕联 探针， 间接标记是采用生物素标记 探针 有荧光素亲和素或者链霉亲和素进行检测，同时还可以 有荧光素亲和素或者链霉亲和素进行检测， 利用亲和素-生物素 荧光素复合物， 生物素-荧光素复合物 利用亲和素 生物素 荧光素复合物，将荧光信号进行放 从而可以检测500bp的片段。 的片段。 大，从而可以检测 的片段 直接标记是将荧光素直接与探针核苷酸或磷酸戊糖骨架 直接标记是将荧光素直接与探针核苷酸或磷酸戊糖骨架 共价结合， 共价结合，或在缺口平移法标记探针时将荧光素核苷三 磷酸掺入。直接标记法在检测时步骤简单， 磷酸掺入。直接标记法在检测时步骤简单，但由于不能 进行信号放大，因此灵敏度不如间接标记的方法。 进行信号放大，因此灵敏度不如间接标记的方法。
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原有的放射性同位素原位杂交技术存在着较多缺点， 原有的放射性同位素原位杂交技术存在着较多缺点，诸如每 放射性同位素原位杂交技术存在着较多缺点 需重新标记探针， 次检验均 需重新标记探针，已标记的探针表现出明显的 不稳定性，需要较和时间的曝光时间和对环境的污染等。 不稳定性，需要较和时间的曝光时间和对环境的污染等。 在观察结果时，需要较多的分裂进行统计学分析。此外， 在观察结果时，需要较多的分裂进行统计学分析。此外， 由于放射性银粒和染色体聚集的不同平面， 由于放射性银粒和染色体聚集的不同平面，可能引起计数 差等。 上的误 差等。 • 与之比 与之比FISH的优点 的优点 • ①操作操作简便 探针标记后稳定 一次标记后可使用二年 操作操作简便,探针标记后稳定 探针标记后稳定,一次标记后可使用二年 • ②方法敏感 能迅速得到结果 方法敏感,能迅速得到结果 • ③在同一标本上 可同时检测几种不同探针 在同一标本上,可同时检测几种不同探针 可同时检测几种不同探针. • ④不仅可用于分裂期细胞染色体数量或结构变化的研究 不仅可用于分裂期细胞染色体数量或结构变化的研究, 而且还可用于间期细胞的染色体数量及基因改变的研究. 而且还可用于间期细胞的染色体数量及基因改变的研究 缺点：不能达到100%杂交，特别是在应用较短的 杂交， 缺点：不能达到 杂交 特别是在应用较短的cDNA 探针时效率明显下降。 探针时效率明显下降。
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染色体涂染探针
人类染色体结构分析
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染色体涂染探针： 染色体涂染探针：染色体结构异常分
析
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多色复合染色体 FISH探针 探针 多色FISH（muti-color FISH) （ 多色 多色复合染色体FISH探针 探针(multiplex 多色复合染色体 探针 FISH, M-FISH probes) 两种以上不同的非同位素标记， 两种以上不同的非同位素标记，不同的 非同位素标记 荧光检测系统， 荧光检测系统，通过不同的滤光片组合 或极少数几种非同位素标记探针后， 或极少数几种非同位素标记探针后，按 照不同的比例混合，可以显示多种颜色。 照不同的比例混合，可以显示多种颜色。
• 简单重复序列探针 简单重复序列探针(simple repetitive probes) ——异染色质着丝粒探针 异染色质着丝粒探针(heterochromatic 异染色质着丝粒探针 centromer probes) • 其靶序列为 卫星DNA或卫星 DNA(alpha 其靶序列为α卫星 或卫星III 卫星 或卫星 satellite/satellite III DNA)多位于染色体的着丝粒和 多位于染色体的着丝粒和 多位于染色体的着丝粒 异染色质区域，重复数百次至数千次。 异染色质区域，重复数百次至数千次。 特点： 特点：信号强 应用：(a)标记染色体识别 应用： 标记染色体识别 (b)染色体数目异常检测 染色体数目异常检测 (c)间期细胞遗传学研究和临床诊断 间期细胞遗传学研究和临床诊断
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简单重复序列探针
染色体的着丝粒
异染色质区域
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简单重复序列探针
• 间期细胞遗传学的意义： 间期细胞遗传学的意义： 遗传学的意义 细胞分裂期仅占整个细胞周期的几分之一至几十分之一， 细胞分裂期仅占整个细胞周期的几分之一至几十分之一， 经细胞培养和相应处理才能获得染色体。 经细胞培养和相应处理才能获得染色体。人体的大部分细 胞并不进行分裂，很难通过培养获得中期染色体分裂相， 胞并不进行分裂，很难通过培养获得中期染色体分裂相， 间期FISH为这一时期遗期传物质的研究提供了可能，而 为这一时期遗期传物质的研究提供了可能， 间期 为这一时期遗期传物质的研究提供了可能 且快速。 且快速。
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染色体涂染探针
• 染色体涂染探针 染色体涂染探针(chromosome painting probes) 整条染色体探针或染色体区带特异性探针 探针来源： 探针来源： 啮齿类(human-rodent) （1）含有人单条染色体的人 啮齿类 ）含有人单条染色体的人-啮齿类 体细胞杂种组织融合的产物； 体细胞杂种组织融合的产物； （2）荧光激活的流式细胞仪 ）荧光激活的流式细胞仪(fluorescence-activated cell sorter,FACS)分离整条染色体 分离整条染色体DNA，并以载体克 分离整条染色体 ， 扩增； 隆/PCR扩增； 扩增 扩增； （3）显微切割得到染色体或染色体片段，PCR扩增； ）显微切割得到染色体或染色体片段， 扩增 • 应用 （1）染色体数目和结构异常分析； ）染色体数目和结构异常分析； （2）不同物种间的同源性比较； ）不同物种间的同源性比较； （3）白血病及其它肿瘤的染色体诊断和研究。 ）白血病及其它肿瘤的染色体诊断和研究。
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单拷贝探针： 单拷贝探针：
（1）种类：YAC， BAC， Cosmid，Plasmid， ）种类： ， ， ， ， cDNA片段 片段 （2）应用 ） 片段及嵌合体克隆验证； （a）定位 ）定位DNA片段及嵌合体克隆验证； 片段及嵌合体克隆验证 （b）确定染色体微小缺失与重复； ）确定染色体微小缺失与重复； （c）染色体断裂点分析。 ）染色体断裂点分析。 （d）间期细胞染色体数目异常诊断。 ）间期细胞染色体数目异常诊断。
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多色复合染色体FISH探针 探针 多色复合染色体
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探针及标本的变性
1）探针变性
• 将探针在 将探针在75 C恒温水浴中温育 恒温水浴中温育5min，立即置 C， 恒温水浴中温育 ，立即置0 ， 5～10min，使双链 探针变性。 ～ ，使双链DNA探针变性。 探针变性 2）标本变性 ） o • ①将制备好的染色体玻片标本于 将制备好的染色体玻片标本于50 C培养箱中烤片 培养箱中烤片 2～3h。（经Giemsa染色的标本需预先在固定液中 。（经 ～ 。（ 染色的标本需预先在固定液中 退色后再烤片）。 退色后再烤片）。 o • ②取出玻片标本，将其浸在 ～75 C的体积分数 取出玻片标本，将其浸在70～ 的体积分数70 的体积分数 甲酰胺/2× 的变性液中变性2～ ％甲酰胺 ×SSC的变性液中变性 ～3min。 的变性液中变性 。 • ③立即按顺序将标本经体积分数 ％、体积分数 立即按顺序将标本经体积分数70％、体积分数90 ％、体积分数 和体积分数100％冰乙醇系列脱水，每次 ％和体积分数 ％冰乙醇系列脱水，每次5min，然 ， 后空气干燥。 后空气干燥。
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单拷贝探针
DNA片段的染色体定位 片段的染色体定位
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单拷贝探针
FISH检测微小缺失 检测微小缺失
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单拷贝探针
FISH检测微小缺失 检测微小缺失
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19(p13.2-13.1) 染色体片段重复 Dup 19(p13.2-13.1)
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简单重复序列探针