桑黄菌液体发酵培养基研究_傅海庆

摘要 目的： 探讨桑黄菌液体发酵的适宜培养基， 为进一步研究其液体发酵工艺及提取有效成分做准备。方法： 首先用单因素单指标法筛选， 再用正交试验双指标法筛选。结果： 桑黄菌生长所需最适 Ｃ／Ｎ 比为 ２４； 最适的碳 源为黄豆粉和玉米粉， 适宜的含量分别为 ４％和 ３％； 最适的氮源为小麦麸粉， 适 宜 的 含 量 为 ０．５％； 对 菌 丝 生 长 发育影响显著的物质有 ＦｅＳＯ４、ＺｎＳＯ４、Ｋ２ＳＯ４、ＣａＳＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＶＢ１ 等。结论： 桑黄菌液体发酵适宜的培养基配方 （ ｇ／Ｌ） ： 黄豆粉 ４０、玉米粉 ３０、小 麦 麸 粉 ５、酵 母 浸 出 汁 ４、ＣａＳＯ４ １０、Ｋ２ＳＯ４ １、Ｎａ２ＨＰＯ４ １．５、ＺｎＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．１、Ｆｅ－ ＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．５、ＶＢ１ ０．１。
２．０２４８
２．１２３０
２．０８４４
ａ
ＡＢ
１．８５３２
１．７２１６
１．７７２４
１．７８２４
ｂ
Ｂ
１．４３９４
１．８１５４
２．０８０４
１．７７８４
ｂ
Ｂ
１．５３４４
１．７２８９
１．９３１５
１．７３１６
ｂｃ
Ｂ
１．５０１８
１．５４０２
１．４６８８
１．５０３６
ｃ
Ｃ
１．２５１６
１．２４５６
１．１６８０
１．２２１７
ｆｏｒ ｌｉｑｕｉｄ ｆｅｒｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｈｅｌｌｉｎｕｓ ｉｇｎｉａｒｉｕｓ（ ｇ／Ｌ）
水 因素 Ａ
因素 Ｂ
因素 Ｃ
因素 Ｄ
平 （ 黄豆粉） （ 小麦麸粉） （ 玉米粉） （ 酵母浸出汁）
１
２０
５
１０
２
２
３０
１５
２０
４
３
４０
２５
３０
６
１．６ 指标测定方法 菌 丝 干 重 和 菌 丝 多 糖 的 测 定 按 参 考 文 献 ［１４］
桑黄菌液体发酵培养基研究
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５９
米 粉 ５０、麸 皮 ３０、ＫＨ２ＳＯ４ ３、ＭｇＳＯ４ １．５、ＶＢ１ ０．１， ｐＨ 自然。
培养条件： 以 １００ ｍＬ／５００ ｍＬ 装量， １ 级种子 接 入 约 １ ｃｍ２ 的 斜 面 菌 种 ， ２ 级 种 子 按 体 积 分 数 １５％的接种量接入 １ 级种子， 旋转式摇床培养 １０ ｄ， 转速 １５０ ｒ／ｍｉｎ， 温度 ２８ ℃。 １．５ 试验方法 １．５．１ 桑黄菌液体发酵营养因子 １．５．１．１ 基 础 培 养 基 （ ｇ／Ｌ） ： 葡 萄 糖 ３０、酒 石 酸 铵 ４、ＫＨ２ＰＯ４ ３、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ １．５、ＶＢ１ ０．１。 １．５．１．２ 培养条件 以 １００ ｍＬ／５００ ｍＬ 装量， ３ 次 重复， 接入体积分数 １０％的 ２ 级菌种， 置于 １５０ ｒ／ ｍｉｎ 的旋转式摇床 ２８ ℃培养 １０ ｄ， 测定其菌丝干 重或菌丝多糖含量。 １．５．１．３ 液体发酵营养因子 Ｃ／Ｎ 比试验 在基础 培养基中， 以 ３０ ｇ／Ｌ 葡萄糖作碳源、不同含量的酒 石酸铵作氮源， 构成 Ｃ／Ｎ 比值分别为 １０、１５、２０、 ２５、３０、３５、４０、４５ 的培养基做试验。 １．５．１．４ 液体发酵碳源试验 选择 ９ 种常见的原 料作为碳源， 其中， 单糖选葡萄糖、果糖、甘露醇， 二糖选蔗糖、乳糖， 多聚碳水化合物选可溶性淀 粉、黄豆、玉米粉和土豆。按 ３０ ｇ／Ｌ 分别加入各种 碳源替换基础培养基中的葡萄糖做试验。 １．５．１．５ 液体发酵氮源试验 选择 ９ 种常见的原 料作为氮源， 其中， 无机氮源选硫酸铵、硝酸铵、硝 酸钠， 有机氮源选酒石酸铵、酵母浸出汁、蛋白胨、 花生饼粉、黄豆饼粉和小麦麸粉。以 ４ ｇ／Ｌ 酒石酸 铵的含氮量 ８３．８ ｍｇ／ｇ 为准， 各种氮源按所含氮量 折算后分别加入并替换基础培养基中的酒石酸铵 进 行 试 验［１２～１３］。 １．５．１．６ 液体发酵所需大量元素、微量元素和维 生素 Ｂ 的试验 拟定 １ 种全元素培养基， 其配方 （ ｇ／Ｌ） ： 葡 萄 糖 ３０、 酒 石 酸 铵 ４、Ｎａ２ＨＰＯ４ １．５、 ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．５、ＭｎＳＯ４·Ｈ２Ｏ ０．１、ＺｎＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．１、ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．５、ＣａＳＯ４ １０、Ｋ２ＳＯ４ １、ＮａＣｌ １、 ＶＢ１ ０．１、ＶＢ２ ０．１， 用超纯水配制， ｐＨ 自然。当研究 桑黄菌对各种大量元素、微量元素和维生素 Ｂ 的 需求时， 其培养基中分别以缺少该种成分进行试 验。 １．５．１．７ 液体发酵碳氮源浓度正交试验 在上述 各营养因子试验的基础上， 选取黄豆粉、玉米粉为
第７卷 第３期 ２００７ 年６月
中国食品学报
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Ｖｏｌ． ７ Ｎｏ． ３ Ｊｕｎ． ２ ０ ０ ７
桑黄菌液体发酵培养基研究
傅海庆 １， ２ 陈绍军 １ 骆文灿 １ 陈汉清 １ 林河通 １ （ １ 福建农林大学食品科学学院 福州 ３５０００２ ２ 福建农林大学科技开发总公司 福州 ３５０００２）
ｄ
Ｃ
１．１０６２
０．９８１６
１．１１７１
１．０６８３
ｄ
ＣＤ
０．９６１３
０．８３７８
０．７６８３
０．８５５８
ｅ
Ｄ
２．１．３ 液体发酵氮源 各氮源对应的菌丝产量见 表 ３。以小麦麸粉作氮源时菌丝生长得最好， 而以 硝酸钠作氮源的菌丝长得最差。方差分析结果显 示氮源种类间的菌丝产量差异达极显著水平 （ Ｆ＝ ４５．８４５ ＞ Ｆ （０．０１， ８， １８） ＝ ３．７１） 。对试验结果做 ＳＳＲ 检 验， 以标记字母法表示品种间多重比较结果。将所 选氮源分为 ３ 组： 第 １ 组： 小麦麸粉， 其菌丝产量
最高； 第 ２ 组： 酵母浸出汁、黄豆饼粉、蛋白胨和花 生饼粉， 其菌丝产量次之； 第 ３ 组： 其菌丝产量较 低。考虑到酵母浸出汁中含有丰富的有利于菌丝 体生长的维生素和矿物质等成分， 而且它的菌丝 产量居第 ２ 位， 为更有利于菌丝的生长， 选取小麦 麸粉和酵母浸出汁作氮源， 同时作为正交试验的 因素。
将其它原料经烘干后磨成细粉， 通过 １５０ 目 金属网， 弃渣后备用。 １．４ 菌种培养 １．４．１ 母 种 的 斜 面 培 养 用 马 铃 薯 培 养 基 （ ＰＤＡ） ， ２８ ℃恒温培养至菌丝长满斜面为止， 冷藏 备用。 １．４．２ 摇瓶液体种子培养 培养基配方（ ｇ／Ｌ） ： 玉
第７卷 第３期
碳源品种
小麦麸粉 酵母浸出汁
黄豆饼粉 蛋白胨
花生饼粉 ＮＨ４ＮＯ３ 酒石酸铵 （ ＮＨ４） ２ＳＯ４ ＮａＮＯ３
表 ３ 氮源对菌丝干重的影响
Ｔａｂｌｅ ３ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅ ｏｎ ｔｈｅ ｍｙｃｅｌｉｕｍ ｄｒｙ ｗｅｉｇｈｔ
菌 丝 干 重／ｇ·（ １００ ｍＬ） －１
菌丝干重／ｇ·（ １００ ｍＬ） －１
０．５ ０．４ ０．３ ０．２ ０．１
０ １０
１５ ２０
２５ ３０ ３５
４０ ４５
Ｃ／Ｎ 比
图 １ 碳氮比对菌丝干重的影响 Ｆｉｇ．１ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｃ／Ｎ ｏｎ ｍｙｃｅｌｉｕｍ ｄｒｙ ｗｅｉｇｈｔ
６０
中国食品学报
２００７ 年第 ３ 期
２．１．２ 液体发酵碳源 各碳源对应的菌丝产量见 表 ２。以黄豆粉作碳源时菌丝生长得最好， 而以土 豆汁作碳源时菌丝长得最差。方差分析结果显示 碳源种类间的菌丝产量达极显著水平（ Ｆ ＝ ３０．５９１＞ Ｆ（０．０１， ８， １８） ＝ ３．７１） 。对菌丝干重结果进行新复极差检 验（ 即 ＳＳＲ 检验） ， 以标记字母法表示品种间多重 比较结果。将所选碳源分为 ４ 组： 第 １ 组： 黄豆粉、
由于天然的桑黄菌数量非常稀少， 加上国内 各产地的掠夺性开采， 已难以成为稳定的工业产 品来源。因此， 寻求人工培育的方法， 研究以大量 易得的菌丝体形式代替子实体入药已成为当务之 急， 这对于保护天然资源、解决资源匮乏、满足市 场需要、提高经济效益， 均具有十分重要的意义。 本文探讨了桑黄菌液体发酵的最适培养基， 为进 一步研究液体发酵工艺及提取桑黄有效成分做 准备。
ＳＷ－ ＣＪ－ １Ｂ 标准型净化工作台、可调速旋转 式摇床、数显恒温水浴锅、旋转蒸发器、ＬＧ１０－ ２．４Ａ 离 心 机 、 隔 水 式 电 热 恒 温 培 养 箱 、１０１－ １ 型 干 燥 箱、显微镜、ＡＢ２０４－ Ｎ 电子天平等。 １．３ 原料的处理
将土豆去皮， 切成小块状或刨成丝状， 称量后 加 入 适 量 水 煮 沸 ０．５ ｈ， 再 以 两 层 纱 布 过 滤 、取 汁 备用。
蔗糖 果糖 甘露醇 乳糖 土豆汁
表 ２ 碳源对菌丝干重的影响
Ｔａｂｌｅ ２ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅ ｏｎ ｔｈｅ ｍｙｃｅｌｉｕｍ ｄｒｙ ｗｅｉｇｈｔ
菌 丝 干 重／ｇ·（ １００ｍＬ） －１
差异显著性
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
ｘｔ
５％
１％
２．１３００
２．０６２０
２．２１９４
２．１３７１
ａ
Ａ
２．１０５４
玉米粉， 其菌丝产量最高； 第 ２ 组： 葡萄糖、可溶性 淀粉和蔗糖， 其菌丝产量次之； 第 ３ 组： 果糖、甘露 醇和乳糖， 其菌丝产量较低； 最后一组是土豆汁， 其菌丝产量最低。其中， 黄豆粉、玉米粉之间菌丝 产量差异不显著， 因此选取黄豆粉和玉米粉作碳 源， 做正交试验。
碳源品种
黄豆粉 玉米粉 葡萄糖 可溶性淀粉
收稿日期： ２００６－ ０７－ ０５ 基金项目： 福建省科技攻关计划重点项目（ Ｎｏ． ２００５Ｎ００８） 作者简介： 傅海庆， 男， １９７３ 年出生， 硕士 通讯作者： 陈绍军
１ 材料与方法
１．１ 材料 １．１．１ 菌种 桑黄菌种由福建农林大学生命科学 学院微生物保藏室提供， 编号为 Ｐｈ．ｌ ０００１。 １．１．２ 原料 黄豆、土豆为市售蔬菜； 玉米粉、麸 皮粉、花生饼粉、黄豆饼粉为市售饲料。 １．１．３ 主要试剂 酵母膏、蛋白胨为生化试剂； 维 生素 Ｂ１、维 生 素 Ｂ２ 为 医 药 品 ； 其 它 试 剂 均 为 分 析 纯。 １．２ 主要设备和仪器
的方法进行， 菌丝用 １００ 目金属网过滤。 １．７ 数据的处理［１５～１６］
用 ＤＰＳ 数 据 处 理 系 统 （ ３．１１ 专 业 版 ） 分 析 试 验数据。
２ 结果与分析
２．１ 桑黄菌液体发酵营养因子 ２．１．１ 碳氮比对菌丝产量的影响 各 Ｃ／Ｎ 比值处 理的菌丝干重如图 １ 所示。碳氮比对菌丝产量的 影响呈抛物线型， 其适宜的比值在 １８～２７ 之间， 菌 丝产量最高的 Ｃ ／Ｎ 比为 ２４， 这与大多数真菌适宜 的 Ｃ／Ｎ 比（ ２０） 相近。方差分析表明， 各比值间有极 显著差异（ Ｆ ＝ ３５．９７６ ＞ Ｆ（０．０１， ７， １６） ＝ ４．０３） 。
碳源， 小麦麸粉、酵母浸出汁为氮源 ， 做四因素三 水平的正交设计（ 见表 １） ， 并配以基础培养基中 除碳、氮源外的成分做试验， 共 ９ 个组合。
表 １ 桑黄菌液体发酵营养因素正交试验因素水平表（ ｇ／Ｌ） Ｔａｂｌｅ １ Ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｔｈｅ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
关键词 桑黄菌 液体发酵 培养基 药用真菌 深层培养 文章编号 １００９－ ７８４８（ ２００７） ０３－ ００５８－ ０６
桑黄菌（ Ｐｈｅｌｌｉｎｕｓ ｉｇｎｉａｒｉｕｓ） 是 １ 种 珍 贵 的 药 用 真 菌 ， ［１～５］ 在 我 国 传 统 中 药 中 ， 主 要 用 以 治 疗 淋 病、崩漏、带下， 疵瘕积聚， 癖软， 脾虚泄泻等［１， ６］； 在 日本则作为利尿剂使用［７］。现代研究发现桑黄有抗 肿瘤的功效， 是目前国际公认的生物治癌领域中 有效率排在第 １ 位的真菌， 从而使其身价百倍。桑 黄菌的抗癌功能最早被日本学者 Ｔｅｔｓｕｒｏ Ｉｋｅｋａｗａ 等［８］发现， 研究表明桑黄菌野生子实体的提取物对 小鼠肉瘤 １８０ 的抑制率为 ９６．７％。研究还表明具 有抗癌作用的物质是桑黄菌子 实 体 中 的 多 糖 。 ［８～９］ 目前， 桑黄在国际医药市场上价格昂贵、供不应 求［１０～１１］。
差异显著性
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
ｘｔ
５％
１％
１．０８６２
０．８０９２
０．８１３６
０．９０３０
ａ
Ａ
０．５７８２
０．６５４９
０．６０７７
０．６１３６
ｂ
Ｂ
０．４６０４
０．５９２６
０．５７１２
０．５４１４
ｂ
ＢＣ
０．４４３３