植物多糖的提取分析

植物多糖提取分离技术的研究进展
2013硕士8班陈林伟20131510
摘要:植物多糖由于其种类的多样性、结构组成的复杂性以及多糖分子量大、极性大等特点给植物多糖提取、分离带来很大困难，利用合适的提取分离技术获得较高的多糖提取率，植物多糖将具有更广阔的发展前景。

关键词:植物多糖；提取；分离；展望
植物多糖是指由许多相同或不同的单糖以α-或β-糖苷键所组成的聚合物，主要包括淀粉、纤维素、果聚糖和果胶质等，由于其葡萄糖残基组成方式与构成形式不同，所以表现的性质有明显的差异[1]。

植物中的糖类通常占其干重的80%~90%，根据其存在的部位，可分为细胞内多糖、细胞壁多糖和细胞外多糖。

植物多糖为白色，无甜味的，可溶于热水或碱液，难溶于冷水，不溶于正丁醇、丙酮、乙醇、醋酸乙酯、乙醚等有机溶剂；pH 值小于 5 时开始降解，小于3时有20%降解，大于7 时氧化速度加剧；当温度大于40 ℃时，分解速度加快；可与硫酸蒽酮、硫酸苯酚反应呈阳性；此外，可与部分无机离子、有机离子络合，如与十六烷基三溴化铵、氢氧化钡等结合产生沉淀[2]。

1 植物多糖的提取技术
植物多糖的提取方法粗略分为三个阶段：去除杂质的方法、破坏细胞壁的方法和多糖提取的方法。

1.1去除杂质的方法
刚刚采摘下来的植物由于水分含量较大，需彻底干燥后进行粉碎，才能用于多糖的提取。

对一些脂肪含量较高的植物，由于脂肪的包裹而使得多糖不易溶出，因此必须先进行脱脂[3]。

超临界CO2流体萃取技术也是一种很好的脱色方法。

目前较为先进的脱脂脱色技术是利用CO2流体为溶剂，从液体和固体中萃取出某种高沸点成分来达到提取分离目的的超临界CO2流体萃取技术[4]。

把温度及压力均处于临界点以上的液体叫超临界流体，CO2在31℃左右时，处于超临界状态。

此时CO2的扩散系数是普通液体的100 倍左右，具有极强的溶解能力，通过对压力、流体流量等的控制，使脂类、色素等杂质完全或大多数完全溶于CO2流
体中，达到去除杂质的目的。

CO2作为超临界流体有很多优点：首先在常温CO2气体的笼罩下进行提取，可以防止对热敏感物质的氧化和逸散，充分保留生物活性；而且整个过程不采用有机溶剂，可以保证萃取的物质绝无溶媒的残留，更加环保；而且CO2价廉易得，不会燃烧，更加安全。

除了脂类和色素外，植物中还存在着大量的植物蛋白。

在用醇沉法提取多糖时，大量的蛋白质也会随之沉淀下来，需要去除。

常用去除植物蛋白的方法有氯仿-正丁醇法（Sevage 法）[5]、酸类物质沉淀法[6]、蛋白酶解法[7]等。

其中氯仿-正丁醇法与酸类物质沉淀法均是利用蛋白质在其中生成凝胶的手段，达到去除蛋白分离多糖的目的；而蛋白酶解法则是通过蛋白酶的作用对蛋白质进行分解，除去蛋白。

这几种方法在应用中各有利弊，比如氯仿-正丁醇法可避免多糖的降解，但效率不高；酸沉淀法可以造成某些多糖的降解，使多糖得率受到影响；蛋白酶解法虽然安全，但通常酶解不够充分，细化程度低。

为了更好地去除蛋白质，科研人员通常将几种方法进行混合使用。

将氯仿-正丁醇法和蛋白酶解法相结合，并利用活性炭吸附作用去除茶树菇多糖提取液中的蛋白质，发现蛋白质去除不但完全，多糖的损失也少，同时还去除了色素、果胶和核酸等杂质[8]。

1.2破坏细胞壁的方法
一般植物的细胞壁比较牢固，需要在提取之前进行专门的破细胞操作，其方法主要包括化学处理、溶胀和自胀、生物酶降解和机械破碎。

植物细胞与动物细胞的不同之处在于，植物细胞具有一层主要由纤维素、半纤维素和果胶类组成的细胞壁。

细胞壁的作用是维持细胞形态，保护和支持细胞，使细胞抗化学降解能力增强，细胞之间连接更为紧密。

只有将细胞壁破坏掉，才能使胞浆中的多糖得以充分的释放。

因此，植物多糖提取过程中最重要的一道工序就是破坏细胞壁。

破坏细胞壁的手段越温和越好，即在破坏细胞壁的同时，尽量避免细胞内多糖的结构遭到破坏，使细胞内多糖最大程度的保持原有形态释放出来。

1.3多糖提取的方法
1.3.1 热水浸提法
这种方法是在前述的脱脂脱色处理后，加水煎煮 2 ～ 3 次，每次 1 ～3h，通过持续不断的加热，使植物细胞壁软化破裂，使多糖溢出，然后经过过滤即可
获得粗多糖溶液。

这种方法的原理是：植物多糖溶于热水特性，通过这种方法较多地保留多糖，不破坏多糖结构。

其优点是成本低廉、工艺简单、无需特殊仪器设备，可用于大规模生产，是最常用的提取多糖的方法。

其缺点是工艺提取时间长，还有待改善[9]。

可使用此法提取植物多糖的范围十分广泛，有根茎植物、植物组织、中药、真菌等多个方面，如甘薯根颈[10]、萝卜[11]、玉米须[12]、银杏叶[13]、大黄[14]、板蓝根[15]、香菇[16]、袖珍菇[17]等。

此法中对多糖提取率存在影响的因素主要有浸提固体液体比例、浸提温度、浸提时间、浸提次数等。

其中提取温度是热水浸提法中影响多糖提取率的主要因素，在研究温度、时间、料液比对山茱萸多糖提取得率的影响时，通过单因素试验和均匀设计试验证实了提取温度是掌控热水浸提法多糖提取率多少的关键因素[18]。

在用热水浸提法提取红枣多糖时，通过单因素试验和正交试验同样得出了提取温度是影响多糖提取率的主要因素这一论断[19]。

同时指出高温长时间水提会对多糖结构与生理活性有不利影响，且增加了去蛋白的难度与工作量，建议在水提时提取温度不宜太高，将温度控制在80℃左右为宜。

1.3.2 超声辅助法
超声辅助法是一种物理破碎植物细胞壁的方法，主要利用了20KHz 以上声波的空化效应。

超声波因这种效应形成小气泡，小气泡会随周围介质的振动而不断运动、长大或突然破灭。

破灭时周围液体突然冲入气泡而产生高温、高压，同时产生激波，使细胞壁瞬间破碎，植物细胞内的有效成分得以释放，直接进入溶剂中并充分混合，从而提高提取率[20]。

不足之处是：超声波还有机械剪切作用，长时间的作用会使大分子的多糖断裂，影响其生物学活性；且超声波功率过大时产生热效应，容器内发生局部瞬时升温现象，也有可能对多糖组分及空间结构造成破坏。

通过超声波法对银杏多糖进行提取，发现采用超声波在功率300W、频率450 次处理银杏浆效果最好，经醇沉可得到纯度高达88.68%的银杏多糖，提取率达到了2.043% [21]。

1.3.3 酶辅助法
酶可以温和地将植物组织破碎分解，使其有效成分释放。

对植物细胞而言，比较常用的酶有纤维素酶、蛋白酶、果胶酶等。

蛋白酶用来去除杂蛋白，而纤维素酶和果胶酶则用来破坏细胞壁。

合理有效地利用酶，可以使浓缩工艺和后续的
脱蛋白工艺操作变得简便易行、省时省力，提高粗多糖的提取率和蛋白质脱除率[22]。

一般来说，此方法为按一定料液比加入样品干粉和生物酶、蒸馏水，在合适温度和PH 值下酶一定时间。

然后升温灭酶，在合适的温度下提取一定时间后，离心取上清液，即可测定多糖含量。

在对茶多糖的提取工艺进行研究时发现，热水一次提取后的茶渣再采用复合酶或果胶酶提取，多糖提取率明显高于单纯的热水浸提法[23]。

1.3.4 微波提取法
微波提取法所提到的微波是频率介于300MHz和300GHz之间的高频电磁波，它能够透入植物细胞内壁。

微波透过对微波透明的溶剂，到达物料内部的维管束和细胞内部，转化成为分子的动能而发热。

连续的高温使细胞内部压力超过其空间膨胀的能力，从而导致细胞壁破裂，释放出细胞内有效成分，进入提取溶剂。

在萃取香菇柄中多糖时选用了微波提取法，最终所得多糖质量分数为90.4%，提取率高达13.2%，而且时间大大缩短[24]。

1.3.5酸提法、碱提法和醇提法
这类方法是通过酸碱醇溶液的充分作用，使植物细胞、细胞壁充分吸水胀膨而破裂，从而使胞内多糖充分释放出来，提高得率，但这些方法只能针对某些多糖，且存在诸多弊端。

酸提法是用适宜浓度的乙酸或盐酸溶于含葡萄糖醛酸等酸性基团的多糖中，再用乙醇将多糖沉淀析出，也可加入铜盐使多糖生成不溶性络合物或沉淀析出。

但是酸性条件下可能引起多糖糖苷键的断裂，因此应使用弱酸为宜。

此外还应注意控制酸作用的时间，否则会降低多糖提取率。

采用酸提法[25]，多糖提取率仅为9.54%，苯酚- 硫酸法测得提取物中多糖含量为20.96%。

碱提法是用弱碱性溶剂提取含有糖醛酸的多糖的一种方法。

为防止多糖降解，常通入氮气或加硼氢化钠。

用碱提法进行大枣渣多糖的提取比用热水浸提法效率大大提高[26]。

醇提法主要是利用少量乙醇可使细胞渗透性增强的原理，提高多糖提取率，常配合碱提法一起使用，称之为醇碱法。

应用醇碱法提取黄芪多糖[27]，在pH值=12 的5%碳酸钠乙醇溶液中多糖提取率高达19.15%，分别是热水浸提法和碱提法的3.53 倍和 2.63 倍。

1.3.6 超声-微波协提法
超声-微波协提法是在低温常压状态下，将超声振动和开放式微波两种作用方式相结合，充分利用超声振动的空化作用以及微波的高能作用，加速被提取物从固相进入溶剂的过程，克服了常规超声提取法和微波提取法的不足，具有节省提取时间、提高提取效率等优点。

赵小亮等[28]用此种方法提取杜梨多糖的提取率为13.91%，比采用热水浸提法提取多糖的提取率高 1.17%。

但该方法最大的不足就是目前市场上的多是超声-微波协同萃取仪，仅可做实验室研究用，无法大规模进行生产应用。

1.3.7 离子交换技术( IET)
离子交换树脂是一类带有功能基的网状结构的高分子化合物。

离子交换技术是利用离子交换、吸附于解吸附的原理，将离子交换树脂官能团上的离子与水中符号相同的离子相交换，失效后的树脂可再生恢复交换能力，继续使用的技术。

离子交换技术可分离各种酸性多糖、中性多糖和粘多糖。

多糖分子中含有许多醇羟基，有极弱的酸性，现在多采用糖中顺式邻二羟基与硼酸可形成复盐阴离子的特性，用硼酸型强碱性或用硼酸容易作为流动相，使多糖分离。

现在最常用阴离子交换法，常用的交换剂有二乙基氨基乙基纤维素[29]。

1.3.8超滤膜技术
超滤是一种膜分离技术，其原理主要是利用膜的筛分作用，以压差为传质推动力，根据分子量的不同将高分子物质与小分子物质分离的方法[30]。

超滤膜不仅能筛选出一定相对分子量范围的多糖，还能除去病菌、热源、胶体和蛋白质等大分子化合物中，可以广泛应用于各种多糖的分离、浓缩和纯化等研究中。

用超滤膜法浓缩薏苡仁多糖提取液，证截留分子量为150kDa 的超滤膜最适合薏苡仁多糖提取液浓缩; 在压力0．13 ～0．21MPa，温度20 ～60℃时，超滤膜通量与压力和温度呈正比，但也会加剧膜通量的下降趋势。

应用超滤膜还需注意应知道被提取多糖的相对分子量，以便选取有效的超滤膜[31]。

2 植物多糖的分离方法
2.1 分级沉淀法
分级沉淀法是在多糖水提液中加入另一种溶剂（如乙醇、丙酮等）以改变混
合溶剂的极性，使一部分物质沉淀析出，从而实现分离。

在多糖水提液中逐级地加入乙醇或丙酮等极性比水小的溶剂，使混合溶剂的极性逐级减小，而具有不同结构的多糖具有不同极性，随着混合溶剂极性的降低，不同极性的多糖逐步沉淀析出而达到分离。

分级沉淀方法所需仪器设备简单、便宜、操作简便，但此法需大量有机溶剂，不但浪费资源，而且对环境造成污染。

分级沉淀法一般用于粗分且只适合分离溶解度相差较大的多糖，因为该法不能让极性相近、结构不同的多糖分离开。

2.2 离子交换色谱法
离子交换色谱法是利用离子交换树脂对各种离子的亲和力不同，从而使能离子化的化合物得到分离的方法。

离子交换色谱法分为阳离子交换色谱法和阴离子交换色谱法。

离子交换色谱法用于分离多糖化合物已经得到广泛应用，其中阴离子交换色谱法比较常用。

阴离子交换色谱法中交换剂常有二乙基氨基乙基纤维素、DEAE-葡聚糖和DEAE-琼脂糖3种。

阴离子交换色谱法一般用于多糖的粗分，通过控制溶液的pH值让多糖溶液中部分蛋白质和色素得到吸附而使多糖得到初步纯化。

以DEAE-纤维素纯化样品，可吸附有色杂质，达到净化、避免污染色谱柱的目的
2.1 乙醇沉淀法
绝大部分植物多糖均有溶于热水而沉淀于乙醇的特性，我们在生产当中主要采用的是乙醇沉淀的方法。

通常在获得的粗多糖溶液中加入95%的乙醇或无水乙醇调至乙醇终浓度不低于60%，静置一段时间后进行离心，所得沉淀即为粗多糖。

将上述步骤重复 2 ～ 3 次，可以得到植物内大部分多糖。

2.3 凝胶柱色谱法
凝胶柱色谱法是根据多糖的分子大小和形状不同而达到分离的方法。

常用的凝胶有葡聚糖凝胶（Sephadex G）、琼脂糖凝胶（Sepharose Bio-gelA）、聚丙烯酰胺凝胶（Bio-gel P）等。

多糖是大分子物质，所以用凝胶柱色谱法对多糖进行分离时多糖分子先流出柱，然后是小分子流出柱，从而达到分离纯化多糖的目的。

在用凝胶色谱法分离多糖时，先将多糖溶液经过离子交换色谱法分离后再上凝胶柱，以除去粗多糖溶液中的色素等杂质。

凝胶一般比较昂贵，所以应尽量避免浪
费，分离多糖后凝胶柱可以再生后重复利用。

2.2 超滤法
在提取苜蓿多糖时还采用了超滤膜分离多糖，在相同条件下，使用超滤膜分离得到的多糖要高于乙醇沉淀的方法，而且获得的粗多糖纯度较高。

但超滤膜在使用前需要进行严格的预过滤，浪费时间和资源；而且超滤膜的价格较高，多糖黏性较大，容易造成超滤膜堵塞损坏，费用昂贵，使得成本增加，不适合大规模生产应用[32]。

3 小结
植物多糖在自然界植物中广泛存在，但由于其种类的多样性、结构组成的复杂性以及多糖分子量大、极性大等特点，给植物多糖提取、分离带来很大困难，要想获得较高的多糖提取率，用单一的提取方法不一定能取得理想的效果，将2种或者多种提取方法结合可能得较好的提取效果。

利用多糖的抗原性、抗肿瘤等活性来制备疫苗，作为抗肿瘤、抗病毒与延缓衰老的药物；在食品方面，活性多糖少剂量时可防止衰老、增加免疫力，所以可将多糖作为一类重要的保健品进行开发；此外，由于多糖具有优越的吸附性、保水性及黏结性，部分研究人员认为将植物多糖用于环境的治理将是该领域的新的研究方向。

因此，低廉的原料成本为多糖提取的工业化、产业化提供了较大的发展空间，植物多糖将具有更广阔的发展前景。

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