饮料中咖啡因含量的高效液相色谱分析

实验八饮料中咖啡因含量的高效液相色谱分析

一、实验目的

1．进一步熟悉和掌握高效液相色谱议的结构。

2．巩固对反相液相色谱原理的理解及应用。

3．掌握外标法定量及Origin软件绘制标准曲线。

二、实验原理

咖啡因又称咖啡碱，属于黄嘌呤衍生物，化学名为1，3，7－三甲基黄嘌呤，是从茶叶或咖啡中提取的一种生物碱。它能兴奋大脑皮层，是使人精神亢奋。咖啡因在咖啡中的含量约为1.2％～1.8％，在茶叶中约为2.0％～4.7％。可乐饮

料、止痛药片等均含咖啡因。咖啡因的分子式为C

8H

10

O

2

N

4

，结构式为：

N

N N N

O

O

3

H3C CH3

在化学键合相色谱中，对于亲水性的固定相常采用疏水性流动相，即流动相的极

性小于固定相的极性，这种情况称为正相化学键合相色谱法。反之，若流动相的极性大于固定相的极性，则称为反相化学键合相色谱法，该方法目前的应用最为

广泛。本实验采用反相液相色谱法，以C

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键合相色谱柱分离饮料中的咖啡因，紫外检测器进行检测，以咖啡因标准系列溶液的色谱峰面积对其浓度作标准曲线，再根据试样中的咖啡因峰面积，由其标准曲线算出其浓度。

三、实验仪器和试剂

1.岛津LC-20A高效液相色谱仪

2. 咖啡因（AR），超纯水由纯水机制得，甲醇为色谱纯，配溶液的甲醇为分析纯。

3. 咖啡因标准溶液的配制

（1）标准贮备液配制含咖啡因1000 ug/mL的甲醇溶液（实验室准备）。（2）标准系列溶液用上述贮备液配置含咖啡因10 ug/mL，20 ug/mL，40 ug/mL，50 ug/mL，60 ug/mL的甲醇溶液，备用。

4. 试样市售的可口可乐和百事可乐

四、实验条件

）颗粒度为5 um的固定相，长150 mm 内径4.6 mm

1. 色谱柱（XDB-C

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2. 流动相甲醇 : 水 = 60 : 40，流量 0.5-1 mL/min

3. 检测器紫外光度检测器，270 nm

4. 进样量 10 uL

五、实验步骤

1.制备所需的流动相，有机溶剂用0.45µm的有机滤膜过滤，水溶液用0.45µm 的水滤膜过滤，于超声波发生器上脱气20 min.

2. 将配置好的分析试样分别过滤后于超声波发生器上脱气15 min.

3. 打开A泵、B泵、检测器、柱温箱及电脑的电源开关。根据分析要求设定柱温箱的温度，没有柱温要求的，设为25℃。

4.待检测器波长检测：出现“CHECK GOOD”，仪器自检完成。此时打开A泵、B 泵的[ DRAIN ]阀，用脱气后的流动相依次进行purge。关闭A泵、B泵的[ DRAIN ]阀。

5. 清洗进样阀。用脱气后的流动相在进样阀的LOAD状态及INJECT状态下来回几次彻底清洗。清洗后进样阀停留到LOAD状态。

6. 根据分析要求，在A泵按[ func ]输入流量按[ enter ]确认，按[ conc ]输B泵的浓度按[ enter ]确认后按[CE]返回初始界面。开始泵的运行。

7.待仪器稳定后，按标准溶液浓度递增的顺序，由稀到浓依次等体积进样10ul （每个标样重复进样3次），准确记录各自的保留时间。

8. 同样取10ul待测饮料试液进色谱分析（重复3次），准确记录各个组分的保

留时间。

9. 根据标准物的保留时间确定饮料中的咖啡因组分峰，计算系列咖啡因标准物和待测咖啡因的峰面积（3次平均值）。

10. 以标准物的峰面积对相应浓度做工作曲线。11.

11. 实验结束后做好仪器使用情况登记，经实验指导老师签名后方可离开实验室。

六、实验数据及处理

1. 处理色谱数据，将标准溶液及试样中咖啡因的保留时间及峰面积列于表中。

2. 用相关软件绘制咖啡因峰面积－质量浓度的标准曲线，并计算回归方程和相关系数。

3. 根据试样溶液中咖啡因的峰面积值，计算可口可乐和百事可乐中咖啡因的质量浓度。

七、思考题

1. 解释用反相柱（ODS）测定咖啡因的理论基础。

2. 能否用离子交换色谱柱测定咖啡因？为什么？

六、实验数据及处理

1.处理色谱数据。

表一：标准溶液的实验数据

表二：试样溶液的实验数据

2.绘制咖啡因峰面积-质量浓度的标准曲线，并计算回归方程和相关系数。表三：绘制咖啡因标准溶液峰面积-质量浓度的标准曲线数据

图一：咖啡因标准溶液峰面积-质量浓度图

图二：咖啡因标准溶液峰面积-质量浓度的标准曲线

所以线性方程为：A=18142c+4840.9

3．根据试样溶液中咖啡因的峰面积值，计算可口可乐和百事可乐中咖啡因的质量浓度。

将A=219512.4代入A=18142c+4840.9得C=11.8μg/mL

4.3

4.4

4.5

4.6

4.7 4.8 4.9

5.0 5.1 5.2 5.3 5.4

5.5min

-0.5

0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.0μV(x10,000)

mL g mL g mL

mL

c /118/1108.11百事可乐μμ=⨯=

即百事可乐中咖啡因的质量浓度

为118 C=11.8μg/mL

（2）可口可乐中咖啡因的质量浓度 将A=194313.1代入得A=18142c+4840.9得C=10.4μg/mL

mL g mL g mL

mL

c /104/1104.10可口可乐μμ=⨯=

,即可口可乐中咖啡因的质量浓度

为104μg/mL 七．思考题。

1.解释用反相柱（ODS ）测定咖啡因的理论基础。

答：反向色谱法中流动相的极性大于固定相，利用样品中各组分在色谱柱中固定相和流动相之间分配系数或吸附系数的差异，将各组分分离后进行检测，并根据各组分的保留时间和响应值进行定性、定量分析。 2.能否用离子交换色谱柱测定咖啡因？为什么？

答：不能，因为离子交换色谱以离子交换树脂作为固定相，树脂上具有固定离子基团及可交换的离子基团。当流动相带着组分电离生成的离子通过固定相时，组分离子与树脂上可交换的离子基团进行可逆变换，根据组分离子对树脂亲合力不同而得到分离。