酶活性测定方法

体系一
酶和蛋白质提取
消过毒的打孔器进行伤口处理后，在每个伤口处添加50μL以下处理：（1）无菌水，对照；（2）浓度为1000μg/mlGA3；（3）浓度为1 ×104 spores/ml P. expansum孢子悬浮液；（4）浓度为1000μg/mlGA3+浓度为1 ×104 spores/ml P. expansum孢子悬浮液。

处理后湿纱布覆盖并用PE塑料膜密封作保湿处理。

贮藏于常温（20-25℃）下。

分别在0、12、24、36和48小时取样进行测定酶活性。

取样时沿伤口用刀小心切下1g果实组织，加入10 mL冷(4℃)的50 mmol/L磷酸缓冲液（PBS）内含1.33 mmol/L EDTA和1% PVPP缓冲液(pH 7.8)。

研钵加入少量液氮预冷后，在冰浴中碾磨，破碎组织，然后在冷冻离心机12000rpm离心15分钟。

取上清液供酶活性和蛋白质含量用。

蛋白质含量测定
试验材料和试剂：牛血清白蛋白标准溶液：准确称取100mg 牛血清白蛋白，溶于100mL 蒸馏水中，即为1 000μg／mL的原液。

8.1.2 蛋白试剂考马斯亮蓝G-250：称取100mg 考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90％乙醇中，加入85％（W／V）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1 000mL。

8.1.3 乙醇；磷酸（85％）。

试验方法：分别取牛血清白蛋白标准溶液（1000μg／mL）0,、10μL、20μL、40μL、60μL、80μL、100μL，无菌水补至100μL，加入考马斯亮蓝G-250试剂5mL，作为标准溶液；
分别取标准溶液和上清液（试验7中得到）400μL加到酶标板，以无菌水置零，测定
OD595；
酶活的测定
9.1 试验材料和试剂
9.1.1 氮蓝四唑；甲硫氨酸；核黄素；过氧化氢；愈创木酚；邻苯二酚。

9.1.2 Na2HPO4-12H2O；NaH2PO4-2H2O。

9.1.3 磷酸缓冲液PBS配制
母液：0.2M Na2HPO4：称取71.6g Na2HPO4-12H2O，溶于1000ml 水；
0.2M NaH2PO4：称取31.2g NaH2PO4-2H2O，溶于1000ml 水。

按表2配制0.2M的PB（mL），最后稀释至所要的浓度
表1 不同pH值PBS的配制
pH
0.2M Na2HPO4（mL）0.2M NaH2PO4（mL）
6.426.5 73.5
7.062 38
7.891.5 8.5
9.2 试验仪器
9.3.1 200μL、1000μL移液枪，eppendorf；
9.2.2 酶标仪，；
9.2.3 酶标板，JET BIOFIL
9.3 试验方法
9.3.1 超氧物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性的测定
SOD采用氮蓝四唑（nitro-blue tetrazolium，NBT）法（Beauchamp和Fridovich，1971）
[6]。

反应步骤为：取200μl粗提液，加入3.7 ml NBT反应液〔50mmol/LpH7.8的磷酸缓冲液（PBS）配制的含77.12μmol/L氮蓝四唑, 100μmol/LEDTA－Na2和13.37mmol/L甲硫氨酸溶液〕，在30℃下保温2分钟后加入100μl核黄素溶液（pH7.8的50mmol/L磷酸缓冲液中含80.2μmol/L 核黄素和100μmol/LEDTA－Na2），在4000Lx日光下反应20min。

然后迅速测定A560。

以不照光的管做空白。

用酶标仪进行测定时按比例调整为总反应体积为400μL。

酶活性按以下公式计算：以抑制NBT光化还原的50％为一个SOD活性单位，结果以U/mg蛋白表示。

以加缓冲液代替酶液的作为对照。

SOD总活性＝(A ck－A E)×V/(A ck×0.5×W×V t)
式中，A ck为照光对照管的吸光度；A E为样品管的吸光度；V为样品液总体积（ml）；Vt 为测定时样品用量（ml）；W为样品鲜重（g）或蛋白质含量（mg）。

9.3.2 过氧化氢酶（Catalase，CAT）活性测定
CA T 活性参照Aebi (1984)[7]的方法进行测定。

用酶标仪进行测定时按比例调整为总反应体积为400μL。

400 μL反应液含50 mmol/L的PBS (pH 7.0)，30 mmol/L的H2O2和50 µL 粗酶液。

反应从加入过氧化氢开始计时，连续测定在240 nm吸光度的降低值。

酶活性定义为：一个过氧化氢酶单位相当于在规定条件下于温度25℃，pH7.0条件下1分钟分解1μmol 过氧化氢所需酶量，结果以U/mg蛋白或U/g鲜重表示。

9.3.4多酚氧化酶（Polyphenoloxidase，PPO）活性的测定
PPO活性测定采用邻苯二酚法（Aquino-Bolaños和Mercado-Silva，2004）[8]。

用酶标仪进行测定时按比例调整为总反应体积为400μL。

350µL反应液（用50mmol/L，pH6.4的PBS配制，内含100µmol/L邻苯二酚）中加入50 µL的粗酶液，平衡1分钟后连续测定398nm 吸光度的变化。

以1分钟内398nm吸光度上升0.01为一个酶活性单位，结果以U/mg蛋白或U/g鲜重表示。

9.3.5 过氧化物酶（Peroxidase，POD）活性测定
POD活性测定采用愈创木酚法（Lurie等，1997)[9]。

用酶标仪进行测定时按比例调整为总反应体积为400μL。

反应体系为30μL粗酶液，290 µL 0.3%愈创木酚（用50 mmol/L的PBS配制，pH 6.4）和80µL0.3%H2O2（用50 mmol/L的PBS配制，pH 6.4）。

反应在加入H2O2后开始准确记时。

连续吸光度在470 nm的上升值。

酶活性以每分钟上升0.01为一个单位，结果以U/mg蛋白或U/g鲜重表示。

体系二
SA对苹果果实抗性相关酶活性的影响
用消过毒的打孔器在每个果实表面形成统一大小和深度的伤口。

每个伤口处等量（30μl）加入（1）SA溶液（10μg/ml）；（2）酵母悬浮液（108 cells/ml）；（3）用SA溶液（10μg/ml）配制的酵母悬浮液（108 cells/ml）；（4）无菌水（作为对照）。

处理后贮藏于常温（20 °C），并用PE塑料膜密封作保湿处理。

定期取样对组织酶活性和蛋白质含量进行测定。

取样时先用无菌刀片表皮组织，然后用打孔器分别在伤口处和离开伤口组织5mm位点取样。

每个处理重复3次，每个重复6个果实。

整个实验重复2次。

2.7.3 SA对梨果实POD活性影响
完好的果实在SA（100 μg/ml）溶液中浸泡10分钟后贮藏于常温（20 °C），然后定期取样对组织POD活性进行测定。

以无菌水处理的为对照。

提取时先用刀片削去表皮组织。

每个处理重复3次，每个重复6个果实。

整个实验重复2次。

2.7.4 酶提取和测定的程序
1克果实组织加入10 ml冷(4℃)的50 mmol l-1磷酸缓冲液（PBS）内含1.33 mmol l-1 EDTA
和1% PVPP缓冲液(pH 7.8)。

加入少量石英砂在冰浴中碾磨，破碎组织，然后在冷冻离心机12000rpm离心15分钟。

取上清液供酶活性和蛋白质含量用。

蛋白质含量按Bradford（1976）的方法进行。

2.7.5 超氧物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性的测定
SOD采用氮蓝四唑（nitro-blue tetrazolium，NBT）法（Beauchamp和Fridovich，1971）。

反应步骤为：取200μl粗提液，加入3.7 ml NBT反应液〔50mmol/l pH7.8的磷酸缓冲液（PBS）配制的含77.12μmol/l氮蓝四唑, 100μmol/l EDTA－Na2和13.37mmol/l甲硫氨酸溶液〕，在30℃下保温2分钟后加入100μl核黄素溶液（pH7.8的50mmol/l磷酸缓冲液中含80.2μmol/L 核黄素和100μmol/lEDTA－Na2），在4000Lx日光下反应20min。

然后迅速测定A560。

以不照光的管做空白。

（用酶标仪进行测定时按比例调整为总反应体积为400μl，下同）。

酶活性按以下公式计算：以抑制NBT光化还原的50％为一个SOD活性单位，结果以U/mg蛋白表示。

以加缓冲液代替酶液的作为对照。

SOD总活性＝(A ck－A E)×V/(A ck×0.5×W×V t)
式中，A ck为照光对照管的吸光度；A E为样品管的吸光度；V为样品液总体积（ml）；Vt为测定时样品用量（ml）；W为样品鲜重（g）或蛋白质含量（mg）。

2.7.6 过氧化氢酶（Catalase，CAT）活性测定
CA T 活性参照Aebi (1984)的方法进行测定。

3ml反应液含50 mmol/l的PBS (pH 7.0)，30 mmol/l的H2O2和50 µl粗酶液。

反应从加入过氧化氢开始计时，连续测定在240 nm吸光度的降低值。

酶活性定义为：一个过氧化氢酶单位相当于在规定条件下于温度25℃，pH7.0条件下1分钟分解1μmol过氧化氢所需酶量，结果以U/mg蛋白表示。

2.7.7 过氧化物酶（Peroxidase，POD）活性测定
POD活性测定采用愈创木酚法（Lurie等，1997)。

反应体系为200μl粗酶液，2.2 ml 0.3%愈创木酚（用50 mmol/l的PBS配制，pH 6.4）和0.6 ml 0.3%H2O2（用50 mmol/l的PBS配制，pH 6.4）。

反应在加入H2O2后开始准确记时。

连续吸光度在470 nm的上升值。

酶活性以每分钟上升0.01为一个单位，结果以U/mg蛋白表示。

2.7.8 多酚氧化酶（Polyphenoloxidase，PPO）活性的测定
PPO活性测定采用邻苯二酚法（Aquino-Bolaños和Mercado-Silva，2004）。

2.9ml反应液（用50mmol/l，pH6.4的PBS配制，内含100µmol/l邻苯二酚）中加入100 µl的粗酶液，平衡1分钟后连续测定398nm吸光度的变化。

以1分钟内398nm吸光度上升0.01为一个酶活性单位，结果以U/mg蛋白表示。

2.7.9 苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanineammonialyase，PAL）活性的测定
PAL活性测定参照Camm和Towers（1973）的方法进行测定。

1ml粗酶液中加4ml硼酸盐缓冲液(pH 8.8)含10mmol/L 苯丙氨酸；对照不加粗酶液，另加1ml蒸馏水。

反应液在恒温水浴30℃中保温0.5h后，测定290nm处吸光度。

以每小时在290nm处吸光度变化0.01所为一单位，结果以U/mg蛋白表示。

2.7.10 脂氧合酶(linoleate:oxygen oxidoreductase，LOX)活性的测定
LOX活性参照Todd等(1990)的方法进行测定。

反应体系为2.8ml反应液（用40 ml浓度为0.1mol/l PBS内含200 μl的Tween 20和40 μl的亚油酸，pH 7.0）中加入200μl的粗酶液。

平衡1分钟后连续测定234nm吸光度的变化。

以1分钟内234nm吸光度上升0.01为一个酶活性单位，结果以U/mg蛋白表示。

体系三（柑橘）
1 酶提取和测定的程序（SOD、POD、PPO、LOX）
0.300 g 果实组织加入4.5 ml冷(4℃)的50 mmol l-1含1.33 mmol l-1 EDTA和1% PVPP PBS缓冲液(PH 7.8)。

加入少量石英砂在冰浴中碾磨，破碎组织，然后在冷冻离心机12000rpm 离心10分钟。

取上清夜作为酶活性等指标样品。

蛋白质含量按Bradford（1976）的方法进行。

1.1 超氧物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性的测定
SOD采用氮蓝四唑（nitro-blue tetrazolium，NBT）法（Beauchamp和Fridovich，1971）。

反应步骤为：取200μl粗提液，加入3.7 ml NBT反应液（50mmol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）配制的含77.12μmol/L 氮蓝四唑, 100μmol/L EDTA－Na2和13.37mmol/L 甲硫氨酸（Met）溶液）后在30℃下保温2分钟后加入100μl核黄素溶液（pH7.8的0.05mol/L 磷酸缓冲液中含80.2μmol/L 核黄素和100μmol/L EDTA－Na2），在4000Lx日光下反应20min。

以加缓冲液代替酶液蒸馏水的作为对照。

然后迅速测定A560。

以不照光的管做空白。

（用酶标仪进行测定时按比例调整为总反应体积为400μl，下同）。

酶活性按以下公式计算：以抑制NBT光化还原的50％为一个SOD活性单位，结果以U/mg蛋白表示。

SOD总活性＝(A ck－A E)×V/(A ck×0.5×W×V t)
式中，Ack照光对照管的吸光度
AE样品管的吸光度
V样品液总体积（ml）
Vt测定时样品用量（ml）。