巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展

第28卷第1期
农业科学研究2007年3月　Vol.28No.1 Journal of Agricultural Sciences Mar.2007
文章编号:167320747(2007)0120068204
巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展
魏凡华1,2,3,曹瑞兵3,吴　润1,陈溥言3
(1.宁夏大学农学院,宁夏银川　750021;　2.甘肃农业大学,甘肃兰州　730071;
3.南京农业大学农业部疫病诊断与免疫重点开放实验室,江苏南京　210095)
摘　要:巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是基因工程研究中广泛使用的真核表达系统,对Pichia pasto2 ris基因结构、载体元件以及影响外源基因表达的因素等进行了较为全面的综述.
关键词:巴斯德毕赤酵母;基因表达系统;研究进展
中图分类号:TQ926.1 文献标志码:A
目前,大肠杆菌类原核表达系统虽然较为成熟,但表达产物以包含体形式存在,无翻译后的糖基化等修饰加工过程,并且可能还会有细菌毒素.昆虫细胞表达存在不正确的糖基化,产物复杂,不易纯化,而哺乳动物细胞表达成本高,产量低.甲基营养型巴斯德毕赤酵母(Pichi a p astoris)已发展成为能够生成多种外源蛋白的卓越表达系统.
1　巴斯德毕赤酵母菌株
一般用于外源基因表达的Pichi a p astoris菌株有Y211430,M2C10023,GS115,KM71,SMD1168等.根据利用甲醇的能力,可将巴斯德毕赤酵母分为3型[1]:①Mut+型为甲醇快利用型,此型毕赤酵母具有完整的AOX1和AOX2基因,绝大多数毕赤酵母为Mut+表型.②Muts型,此型毕赤酵母(如KM71)菌细胞AOX2基因编码的醇氧化酶可依赖15%AOX活性,为甲醇慢利用型.③Mut2型(如M2G10023),此型毕赤酵母AOX1及AOX2基因均被敲除,为甲醇不利用型.研究发现,蛋白酶缺陷型毕赤酵母,如SMD1163, SMD1165和SMD1168可有效降低外源目的蛋白的酶解.一般说来,蛋白胞内表达时,优先考虑用Muts表型,对于分泌表达,Mut+和Muts都可使用.甲醇慢利用型有时比Mut+型菌株能够达到更高的表达量[2].
2　Pichi a p astoris表达载体
载体是由许多元件构成的,包括启动子、终止子、选择标记、报告基因、复制起点和信号肽序列等,典型的表达载体含有乙醇氧化酶基因5′AOX1启动子和3′AOX1终止子,其中含有供外源基因插入的多克隆位点,以组氨醇脱氢酶基因HIS4作为互补筛选标志或ZeocinR作为筛选标志.
2.1　启动子
Pichia pastoris含有两个基因编码醇氧化酶: AOX1和AOX2,二者序列有92%同源性,但是AOX1表达水平高于AOX2.AOX1启动子的表达受甲醇严格调控[3].以甲醇为碳源生长时,约5%的mRNA 由AOX1基因转录.P GA P(三磷酸甘油醛脱氢酶启动子)是最近在毕赤酵母中克隆到的一个组成型启动子,GA P启动子不需甲醇诱导,发酵工艺更为简单.Vassilen利用GA P启动子表达乙肝表面抗原获得高表达[4],Genzyme也利用GA P启动子表达人几丁质酶,不仅获得高表达,而且还可以避免蛋白酶水解[5].Phongdara在H ansenul a pol y mor p ha克隆到酸性磷酸酶(p HO1)基因启动子[6].这些启动子丰富了甲醇酵母对启动子的选择.
2.2　选择标记
选择标记一般为对应于营养缺陷型受体的野生型基因,常用HIS4,也可用来源于酿酒酵母的AR G4基因和SUC2基因.kanr基因和Shbler基因能够作为细菌和酵母菌的选择标记,因此较其他表达载体更易于筛选.
2.3　信号肽序列
可供毕赤酵母选择的信号肽有外源蛋白自身的
收稿日期:2006205220
作者简介:魏凡华(19802),男,宁夏隆德人,硕士研究生,主要从事微生物学与免疫学研究.
信号肽和酵母本身的信号肽.
有些蛋白的自身信号肽不能被毕赤酵母有效利用,可试用甲醇酵母信号肽.目前可供选择的酵母信号肽有α2交配因子的前导肽序列、酸性磷酸酶信号肽和蔗糖酶信号肽等.其中酿酒酵母α2交配因子前导肽序列的使用最为广泛.酶切割位点周围氨基酸序列及外源蛋白的3级结构可以影响信号肽的加工效率.Waterham 等也利用定向肽在巴斯德毕赤酵母中成功地将PG AP 启动下的β2半乳糖苷酶定向输送到过氧化物酶体[7].2.4　表达载体的种类
Invit rogen 公司开发出了若干系列的表达载体可供选择.当前常用的巴斯德毕赤酵母表达载体可分为2类.①胞内表达载体.如p HIL 2D2,p AO815,p PIC3K ,PICZ ,p HWO10,p GA PZ.②分泌表达载
体.如p HIL 2S1,p PIC9K ,p PICZ
α,p GA PZ α[8].目前主要采用酵母内源性的信号肽来引导外源基因表达产物的分泌,常用A2因子信号肽.许多蛋白的正确构像和翻译后加工(如糖基化等)都是在分泌途中完成的.
3　基因整合
证明表达载体构建正确后,转入巴斯德毕赤酵
母中诱导表达.毕赤酵母转化方法最常用的是电转化法和原生质体法,其中电转化法最为方便,转化效率最高,最容易产生多拷贝整合.ZeocinR 抑制细胞壁的形成,因此PICZ 系列不能使用原生质体法进行转化.转化时,载体DNA 必须切成线状才能与染色体进行同源重组,将整个载体连同外源基因整入宿主染色体.通常有以下几种整合方式:①双位点互换.发生在染色体AOX1位点和表达质粒中的P AOX1及转录终止区,产生的表达菌的表型为His +Mut -[9]
.②AOX1单位点互换.发生在染色体和表
达质粒的AOX1区.产生的表型是His +Mut +.③
His 单位点置换.发生在染色体His 位点和表达质粒的His 位点,使得1个或多个表达单位插入在His 位点,产生的表型也是His +Mut +.巴斯德毕赤酵母载体在宿主染色体上大多为单拷贝整合,由于PAOX1的强启动性和整合后的稳定性,所以单拷贝也能获得较高的产量.
4　重组蛋白翻译后修饰
Pichi a p astoris 能进行与高等真核细胞相似的
许多翻译后修饰,包括二硫键形成、信号序列加工、折叠、O 2连接和N 2连接糖基化等.巴斯德毕赤酵母对分泌的外源蛋白的糖基化已成为研究的热点.巴
斯德毕赤酵母对外源目的蛋白的糖基化作用具有2个主要特征:①极少出现过度糖基化.一般情况下Pp 能产生较酿酒酵母明显要短的高甘露糖型寡糖链,且较均一,长度在8～14个之间,使产物更加稳定.②糖链中不含具有潜在致敏作用的α21,32甘露糖[10].然而,一些在天然分泌时不被糖基化的蛋白,由巴斯德毕赤酵母表达时却可能发生糖基化.如人体内合成的胰岛素样生长因子I 为非糖基化蛋白,而由巴斯德毕赤酵母表达时,却有15%发生了糖基化作用[11].不合适的糖基化和寡聚体可能会在机体内产生免疫反应或毒副作用,解决这一问题的可能方法主要是尝试胞内表达,利用基因工程改造糖基化位点[12],用糖苷酶进行处理,降低抗原性[13].
5　影响外源基因表达的因素
影响外源基因在巴斯德毕赤酵母中表达的因素主要包括:外源基因自身的特性、表达框的拷贝数、染色体整合位点和方式、宿主菌的甲醇利用表型、基因剂量、分泌信号、产物稳定性、翻译后修饰以及培养条件等[14].5.1　外源基因自身的特性
外源基因在P.p 中表达时,其自身就是影响表达水平的重要因素.许多高A +T 质量分数的基因常会由于提前终止而不能有效转录,不合适的mRNA 5′非翻译区的核苷酸序列和长度也可能会影响基因的正常表达.Sreekrishna 等通过调整人血清白蛋白的mRNA5′非翻译区与醇氧化酶的5′非翻译区相同后,HSA 的表达量可以提高50倍以上[15].赵翔等研究证明,Pichia pastoris 有密码子偏爱倾向[16].所以一般需要进行全基因合成,使编码序列符合毕赤酵母偏爱密码子用法和具有更高的G +C 质量分数.5.2　表达框染色体整合位点巴斯德毕赤酵母中的稳定高效表达主要通过整合性载体实现.整合性载体的表达盒稳定,可以多位点整合而获得多拷贝以及进行不同整合方式.AOX1和组氨酸脱氢酶(HIS4)基因位点都已被成功用于表达外源蛋白.Sreekrishna 等认为,由于表达框中his4染色体突变拷贝与完好的his4基因能够发生基因转换,所以首选aox 1位点作为整合位点.5.3　宿主菌的甲醇利用表型
原则上,如果是胞内表达,应尽量用Mut -细胞,这样得到的蛋白产物中醇氧化酶蛋白量较少而蛋白纯化更易进行.现在无需甲醇诱导的组成性表
达载体p GA PZ 和p GA PZ
α已经构建成功,它们常能生产比诱导型载体p PICZ 和p PICZ
α更高的外源9
6　第1期 魏凡华等:巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展
蛋白.Doring等研究表明,在生产哺乳动物膜转运蛋白时,p GA P比pAOX1更理想.
5.4　基因剂量
一般来说,高拷贝整合可以提高表达量,但许多实例表明,含单拷贝表达框的宿主菌足以得到最佳产量.Jeffrey等发现,重组CD40L的最高产量是在有8个以上表达框的菌株中获得的[17].不过个别情况下拷贝数增加对产量也会产生负效应,原因可能在于过高表达会对分泌途径产生负反馈抑制.因此,高表达菌株的筛选只应以表达的蛋白量为唯一标准,基因剂量与表达水平的关系取决于特定的外源蛋白.Jeffrey等建立了一种双滤膜筛查方法,可以快速地从大量重组菌株中筛选出高表达克隆.
5.5　分泌信号
不适合的信号肽可导致信号肽加工不完全,或者蛋白分泌水平低,甚至不能分泌.尝试不同的信号肽,对信号肽进行突变改造或人工全合成信号肽等策略可用于实现信号肽正确加工和提高分泌水平[18].韦宇拓等利用菊粉酶的信号肽序列来构建巴斯德毕赤酵母分泌载体并表达了B2葡聚糖酶,结果表明ISP信号肽序列分泌效率不低于利用A因子信号肽的表达载体p P IC9K.Singh等通过定向缺失诱变导致了含有天然N端的成熟干扰素的正确释放,可以成为解决这一问题的一种好方法.
5.6　发酵系统培养
巴斯德毕赤酵母在发酵系统中外源基因的转录水平是过量甲醇诱导时的3～5倍.可有效监控p H、通气量和碳源浓度并及时排出代谢产物,控制维持产物稳定性的因素,可达到最优化发酵条件,使蛋白产量在标准以上水平.现在已建立了较成熟的补料分批培养制度和连续灌注培养方法.
5.7　产物稳定性
酵母细胞膜上有一种KEXO2样蛋白水解酶,能专一性水解α因子前体中羧基端的肽键.改变培养基的p H值,推荐范围为2.8～6.5,加入适量的酵母提取物和蛋白胨,都能够提高外源蛋白的稳定性,而某些酶抑制剂在增加其稳定性的同时会使一些原先并不明显的蛋白变得非常明显,影响其使用效果.另外,使用蛋白酶缺陷株如SMD1163, SMD1165或SMD1168亦可避免产物降解的发生.在另外一种情况下,如果基因工程产物会影响宿主菌生长代谢活性的话,也可能出现高度降解的情况.
6　结束语
巴斯德毕赤酵母(Pichi a p astoris)表达系统是近年发展起来的一种新型真核表达系统,具有发酵工艺成熟,易于工业化,培养成本低廉,又具有真核表达系统,可进行蛋白翻译后的修饰、加工和折叠等优点,而得到广泛应用,目前许多诊断用的抗原及治疗用的疫苗都有在P Pichi a p astoris中得到表达.巴斯德毕赤酵母表达系统具有极好的生产应用前景,其主要优势如下:①巴斯德毕赤酵母表达载体整合后具有高稳定性.②可进行胞外表达和胞内表达,胞外分泌表达更有利于蛋白纯化.③发酵培养适合进一步大规模生产.④表达蛋白的加工修饰适中.但巴斯德毕赤酵母的更广泛应用,还有待于对此体系进行进一步的研究和开发.
参考文献:
[1]　CREGG J M,CEREGHINO J L,SHI J,et al.Re2
combinant protein expression in Pichia pastoris:a re2
view[J].Molecular Biotechnology,2000,16(1):
23252.
[2]　CREGG J M,V EDV IC K T S,RASCH KE W C.Re2
cent Advances in the expression of foreign genes in
Pichia pastoris[J].Teclmology,1993,11(8):9052
910.
[3]　CREGG J M,MADDEN K R,BARRIN GER K J,et
al.Functional characterization of the two alcoholoxi2
dase genes f rom the yeast Pichia pastoris[J].Mol
Cell Biol,1989,9:131621323.
[4]　VASSIL EVA A,GHU GH D A,SWAMINA T HAN
S,et al.Expression of hepatitis B surface antigen in
the methylotrophic yeast Pichia pastoris using the
GAP promoter[J].J Biotechnol,2001,88:21235. [5]　GOODRIC K J C,XU M,FINN EGAN R,et al.
High2level expression and stabilization of recombinant
human chitinase produces in a continuous constitutive
Pichia pastoris expression system[J].Biotechnology
and Bioengineering,2001,174:4922497.
[6]　P HON G DARA A,M ERXKELBACH A,KEU P P,
et al.Cloning and characterization of the gene enco2
ding a repressible acid phosphatase(p HO1)f rom the
methylotrophic yeast Hansennula pol y morpha[J].
Appl Microbiol Biotechnol,1998,50:772841.
[7]　WA TER HAM H R,DIGAN M E,KOU TZ P J,et
al.Isolation of the Pichia pastoris glyceraldehydes23′
22phosphate and regulation and use of its promoter
[J].Gene,1997,186(1):37244.
[8]　SEARS I B,CONNOR J,RO SSAN ESE O W,et al.
A versatile set of vectors for constitutive and regulated
gene expression in Pichia pastoris[J].Yeast,1998,14
(8):7832790.
[9]　CEREGHION J L,CREGG J M.Heterologous protein
07农业科学研究 第28卷　
expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris [J ].FEMS Microbiology Rev ,2000,24(1):45266.
[10]　MON TEINO R ,GARCIA R ,QU IN TERO O ,et al.
Variation in N 2linked oligosaccharide structures on heterologous proteins secreted by the methylotrophic yeast Pichia pastoris [J ].Protein Expr Purif ,1998,14(2):1972207.
[11]　BRIERL EY R A.Secretion of recombinant human in 2
sulin 2like growth factor I (IGF 21)[J ].Methods Mol Biol ,1998,103:1492177.
[12]　U RBA TSCH I L ,WIL KE 2MOUN TS S ,GIMI K ,
et al.Purification and characterization of N 2glycosy 2lation mutant mouse and human P 2glycoproteins ex 2pressed in Pichia pastoris cells [J ].Arch Biochem Biophys ,2001,388:17121771.
[13]　CALL EWA ER T N ,L AREY W ,CADIR GI H ,et
e of HDEL 2tagged Trichoderma reesei manno 2syl oligosaccharide 1
,22alpha 2D 2mannosidase for
N2glycan engineering in Pichia pastoris [J ].FEBS
Lett ,2001,503:1732178.
[14]　SREEK RISHNA K ,BRAN KAMP R G ,KROPP K
E ,et al.Strategies for optimal synthesis and secre 2tion of heterologous proteins in the methylotrophic yeast Pichia pastoris [J ].G ene ,1997,190(1):55.
[15]　SREEKRISHNA K ,BARR K A ,HOARD S A ,et
al.Expression of human serum albumin in Pichia pastoris [J ].Yeast ,1990,6(special issue ):447.
[16]　赵翔,霍克克,李育阳.毕赤酵母的密码子用法分析
[J ].生物工程学报,2000,16(3):2082211.
[17]　CL ARE J J ,ROMANOS M A ,RA YM EN T F B ,et
al.Production of mouse epidermal growth factor in yeast :high level secretion using Pichia pastoris strains containing multiple gene copies [J ].Gene ,1991,105,2052212.
[18]　熊爱生,彭日荷.信号肽序列对毕赤酵母表达外源蛋
白质的影响[J ].生物化学与生物物理学报,2003,35
(2):1542160.
R esearch progress of the expression system of Pichia pastoris
W ei Fanhua
1,2,3
,Cao R uibi ng 3,W u R un 1,Chen g Puy an
3
(1.School of Agriculture ,Ningxia University ,Y inchuan 750021,China ;
2.Gansu Agricultural University ,Lanzhou 730071,China ;
3.Nanjing Agricultural University ,Nanjing 210095,China )
Abstract :As a eukaryote expression system ,Pichi a p astoris has been widely used in genetic engineering ,has many merit s in t he gene exp ressio n.These factors including t he st ruct ure of gene ,secretion signal peptides ,vector element s ,and factord influenced exp ression levels etc are analyzed.K ey w ords :Pichi a p astoris ;gene expression system ;research
(责任编辑、校对　武晓兰)
土地面积法定单位及其大致使用场合
关于土地面积的法定计量单位,已于1990年12月28日由农业部、国家土地管理局和国家技术监督局联名发部的文件(该文件经国务院批准)中公布(见下表),从1992年1月1日起实施.
土地面积法定单位及其大致使用场合
名称
中文符号国际符号
换算关系
大致使用场合平方千米,平方公里
千米2km 21km 2=106m 2
国家版图,地区疆域面积公顷公顷hm 21hm 2
=104
m 2
=15市亩
耕地、林地、草地面积平方米
米
2
m
2
建筑面积,宅基地面积
注:土地面积单位“亩”是非法定单位,应停止使用.
1
7　第1期 魏凡华等:巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展。