【开题报告】鱼蛋白生物发酵液的抗氧化性和功能性研究

开题报告

食品科学与工程

鱼蛋白生物发酵液的抗氧化性和功能性研究

一、综述本课题国内外研究动态，说明选题的依据和意义

自由基是含有未成对电子的原子、分子或原子团,性质活泼,易夺取其它分子或原子上的电子,从而破坏其它分子或原子的结构。在生物体生命活动的氧化代谢过程中，不断地产生各种自由基，自由基会引发体内脂质过氧化,加快机体的衰老过程,并可诱发心血管、癌症等疾病[1，2]。超氧阴离子自由基(O2·)是全部氧自由基中首先生成的，本身有毒害作用，还可通过歧化反应产生H2O2，然后生成羟基自由基(·OH)[3]。羟自由基(-OH)是生物体内最活泼的活性氧，可以引发许多病理变化，例如引发不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，并损伤膜结构及其功能等[4]。

许多研究显示，由于酶解，在完全蛋白质中常见的功能性如溶解性、凝胶性、乳化性和粘性等与之前不同，酶解产物很大程度由分子大小或者水解度决定。蛋白质的溶解度除与自身结构有关外，还受pH、温度、蛋白浓度和离子强度的影响。蛋白质的一些功能性如发泡性、乳化性、凝胶性和增稠作用与它的溶解度有关。

随着人们生活水平的提高，他们对于抗氧化剂的要求也越来越高，期望以天然抗氧化剂来减少合成抗氧化剂的应用，从而减少抗氧化剂造成的毒副作用，因此他们对于天然抗氧化剂的研发抱有很大期望。鱿鱼蛋白通过酶解得到的水解产物具有较好的抗氧化性，但同时其乳化性和起泡性也发生改变。肖枫等人[11]利用前鱿鱼浆通过菠萝蛋白酶水解，对羟自由基的清除率达到0.6%。另外资料显示，海棒糙胶原蛋白水解物对超氧阴离子的清除率可达52.2%。水解产物的羟自由基清除率随着酶解时间的延长而增强，酶解8h得到的鱿鱼水解物的羟自由基清除率达到71.5%。因此研究证明鱿鱼水解物对Fenton体系产生的羟自由基具有较强的清除力。

Hordur等[16]从鲑鱼幽门垂中提取内源酶提取物,鲑鱼肉通过酶水解得到的水解蛋白具有良好的乳化性。蛋白质的溶解性决定了蛋白、油、水体系的乳化性和乳化稳定性[17]。这是由于在油-水界面上蛋白质膜的稳定性，同时由起促进作用的蛋白质-油相和蛋白质-水相的相互作用决定的。Wu H C等[18]利用鲭鱼蛋白分别通过自溶法和商业用酶法酶解,获得3种活性多肽,具有很好的DPPH清除作用和亚油酸自动氧化抑制作用。Jun S Y等[19]从金枪鱼的水解产物中分离得到多种抗氧化活性肽，研究表明多肽的功能特性与分子量大小密切相关,不同分子量的抗氧化肽,表现出了不同的抗氧

化性。蛋白质是一种表面活性剂，不仅能降低水和油的表面张力，易于乳化，同时能分散在非连续向何连续相之间的界面上，阻止非连续相的聚集，起到稳定乳状液的作用[20]。

通过本次实验对于天然抗氧化剂的开发利用具有重要意义，同时测定其功能性，为其今后的功能性产品开发提供了研究基础。

二、研究的基本内容，拟解决的主要问题：

本课题研究的是以小杂鱼蛋白生物发酵液为原料，对其抗氧化性进行研究，包括DPPH自由基清除率、金属螯合率等进行了实验测定。同时对其包括发泡性、溶解性在内的功能性进行了测定，通过实验结果来确定不同蛋白浓度和pH对鱼蛋白生物发酵液的抗氧化性和功能性的影响。

三、研究步骤、方法及措施：

鱼蛋白发酵液的抗氧化性和功能性测定：

1. 清除DPPH自由基的能力测定：

1mL样品同1mL 99.5% 乙醇混合，加上250 μL浓度为0.02% DPPH 99.5% 乙醇液剧烈混合，混合物在暗室温度下放置60min，然后测定在517nm处的吸光值。

计算公式：DPPH自由基清除率={对照-（样品-空白）}/ 对照*100%

2. 还原力测定：

取1mL不同蛋白浓度样品溶液，加入1mL 0.2mol/L pH6.6的PBS溶液，再加入1mL 1%的铁氰化钾，在50℃水浴中20min后加入1mL 10%的三氯乙酸，然后在3000r/min的离心机离心5min，取上清液2mL，加入2mL蒸馏水再加入0.8mL 0.1%氯化铁，然后700nm处测定吸光值，吸光值高表示还原力强，自由基清除率也越高。计算公式：还原力=样品-对照

3. 金属螯合率测定：

1.5mL样品液同1.5mL蒸馏水混合，然后同0.1mL 2mM FeCl2和0.2mL 5mM菲咯嗪混合，室温放置20min，测定在562nm处的吸光值。计算公式：螯合率=[对照-（样品-空白）]/对照*100% 4. 清除羟自由基能力的测定：

1mL 0.75mM 邻二氮菲与2.0mL pH7.4 PBS 混合，再加上1mL蒸馏水，1mL 0.75mM FeSO4，1mL 0.12% H2O2，于37℃下置于暗室60min，结果记作Ap；

1mL 0.75mM 邻二氮菲与2.0mL pH 7.4 PBS混合，再加上1mL 蒸馏水，1mL 0.75mM FeSO4，1mL蒸馏水，于37℃下置于暗室60min，结果记作Ab；

1mL 0.75mM 邻二氮菲与 2.0mL pH 7.4 PBS混合，再加上1mL样品，1mL 0.75mM FeSO4，1mL 0.12% H2O2，于37℃下置于暗室60min，结果记作As；

于536nm处测定吸光值。计算公式：羟自由基清除率={(A s-A p)/A b}*100%

5. 发泡性测定：

4.2mL样品液分别调节pH为2，4，6，8，10，然后在16000 rpm室温均质混合2 min吸收空气，搅拌后的样品立刻转至10 mL量筒中，30s后读体积。体积越大说明发泡性好；体积差越大，说明泡持性差。计算公式：泡沫形成能力=（A-B）∕B*100%

注：A：沉淀后体积（mL）

B：搅拌前体积（mL）.

6. 溶解性测定：

量取2mL蛋白液于离心管内，用1 or 6 N HCL 和1 or 6 N NaoH 调节pH分别为2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，置于摇床150r∕min，振荡30min，7500rpm，离心10 min，从上清液中吸取0.1mL于试管中，用蒸馏水稀释至1mL，加5mL考马斯亮蓝，摇匀，静置5min，于595nm 处测定吸光值。计算公式：溶解度=（样品吸光值/原液吸光值）*100%

7. 乳化性测定：

取2.7mL蛋白液，调节pH分别为2，4，6，8，10，加入0.9mL植物油，用均质机在

20000rpm均质1 min，在均质后0 min 和10 min时分别从容器底部吸取50 μL乳化液与5mL质量分数为0.1%的SDS混合后测定稀释液在500nm处的吸光值。乳化形成立刻测定的A0和乳化10min后测定的A10用计算乳化形成指数和乳化稳定指数。计算公式：

EAI（㎡∕mL）=（2*2.303*A500 ）∕（0.25*蛋白液体积）

ESI（min）=（A0 * △t）∕△A

注：△A=A0-A10

△t=10min

四、参考文献

[1] Pryor W A.Cigarette smoke and the involvement of free radical reaction in chemical carcinogenesis [J]. Br. J. Cancer, 1987，55(8):19~23.

[2] Bermudez E.Stone K.Career K M.et al. Environmental tobacco is as damaging to DNA as mainstream smoke [J]. Environ. Health Perspect，1994，102:870~874.

[3] 陈瑾歆,唐聪明.氧自由基的研究进展[N].海南医学院学报, 2004, 21~24.

[4] 许庆陵,曾庆祝,朱莉娜,崔铁军.醚酶解物对羟自由基的清除作用[N].水产学报，2004, 28. 2(6):45~49.

[5] Liu G,Xiong Y L.ElectropHoretic Pattern,Thermal De－naturation,and in Vitro Digestibility of