亲和纯化技术

亲和介质结合目标分子后，通过改变物理场 使介质与目标分子共同沉淀

亲和配基固定在 膜孔表面，流体在 对流状态下透过膜 孔的过程中目标蛋 白与配基接触而被 吸附
亲和错流过滤-定义
亲和错流过滤是生物亲和相互作用 与膜分离相结合的蛋白质类生物大分 子的分离纯化技术
亲和错流过滤-原理



传统的膜过滤对蛋白质的分离是基于分子量 大小的差异；分子量相差10倍以上的物质可 得到分离，选择性差； 将亲和配基固定于某些水溶性聚合物或不溶 性微粒后，目标蛋白质将选择性地吸附于这 些修饰亲和配基的材料上，从而在目标蛋白 质与杂蛋白之间形成较大的尺寸差，提高膜 分离选择性 目标产物被截留并经洗脱获得纯品
亲和色谱定义
亲和色谱是利用亲和吸附作用分离纯化生物 物质的液相色谱法。
亲和色谱所用的固定相为键合亲和配基的亲 和吸附介质（亲和吸附剂）
亲和色谱原理
亲和色谱操作与一般的固 定床吸附操作方式相似，
多采用断通式前端分析
法，分为进料、杂质清 洗、目标产物洗脱合层 析柱再生四步。
亲和色谱原理

料液进料（feedstock loading）
含有目标产物的料液连续通入色谱柱，直至目标产 物在色谱柱出口穿透

杂质清洗(contaminant washing)
利用与溶解原料的溶液组成相同的缓冲液为清洗液， 清洗色谱柱除去不被吸附的杂质；

产物洗脱(target product elution)
利用可使目标产物与配基解离的溶液洗脱目标产物

柱再生（column regeneration)


溴化氰活化法用于亲和色谱介质连接含有氨基的配 基 最初的溴化氰活化法，需要加入NaOH至pH为11， 成功地将配基连接到软性介质上。但是，溴化氰是 剧毒试剂，并且具有挥发性。 溴化氰活化介质后形成的氰氧基容易水解，而影响 偶联效率，活化后的介质带有较强的电荷，导致非 特异性吸附增加等。
介质的活化方法－环氧基法
各类脱氢酶和激酶需要在辅酶存在下表现出其生物催化活性。 辅酶和脱氢酶之间有亲和作用。

三嗪类色素
这类色素与NAD的结合部位相同，具有抑制酶活性的作用， 能与脱氢酶、血清白蛋白、干扰素、核酸酶、溶菌酶等发生 结合作用
亲和配基－过渡金属等

过渡金属离子
Cu2+等过渡金属离子可与蛋白质表面的组氨酸的咪唑基发生 亲和结合作用。Cu2+等过渡金属离子与N、O和S等供电原子 产生配位键。
亲和错流过滤-特点

优点
吸收膜分离的优点，易于放大和连续操作
吸收亲和吸附高选择性的特点
亲和载体无内扩散阻力，目标分子的亲和结合速度快

缺点
一级吸附平衡、一个理论板、效果差
其他亲和过程
-亲和双水相萃取

亲和双水相萃取是利用偶联亲和配基的聚乙 二醇作为成相聚合物进行目标产物的双水相 萃取
在亲和配基的亲和作用下，促进目标蛋白在 PEG相中分配，提高分配系数和选择性
亲和色谱
-间隔臂的作用

当配基分子量较小时，为 了排除空间位阻作用，需 要在配基和载体之间连接 一个“间隔臂”
间隔臂的长度有一定限制， 超过一定长度后，配基与 目标分子的亲和力会减弱

亲和色谱
-影响亲和吸附的因素

杂质的影响
料液中目标产物浓度很低，杂质很多，少量杂质 的非特异性吸附，会大大降低纯化效果 杂质的非特异性吸附量与其浓度、性质、载体材 料、配基固定化方法等众多因素相关



环氧氯丙烷活化具有方便、快速、活化率高，毒性 低的特点，是目前广泛采用的制备方法。 活化方法：将介质用水冲洗后，加入环氧氯丙烷和 适当浓度的NaOH，然后振荡反应2.5h左右。 为了得到更高的活化效率，其中环氧氯丙烷和 NaOH的用量，NaOH的浓度，反应时间都可以根 据具体实验做出调整。 由于环氧氯丙烷为油相，而NaOH溶液为水相，为 了促进两者反应的进行，通常在混合物中加入助溶 剂二甲基亚砜（DMSO）。
亲和膜-定义
亲和膜是利用亲和配基修饰的微滤膜
为亲和吸附介质亲和纯化目标蛋白质， 是固定床亲和层析的变型。
亲和膜-亲和膜的提出

固定床亲和层析的缺陷
以多糖凝胶为固定相，机械强度低，流速受限 放大困难（放大采用径向放大）

亲和膜思路提出
“降低柱高、增大柱径以降低压降、提高流速”
亲和膜-亲和膜的原理
亲和色谱
-目标产物的非特异性洗脱
非特异性洗脱是提高洗脱液的pH值、离子强 度、离子种类或温度等理化性质降低目标产物的亲 和吸附作用，是较多采用的洗脱方法。当亲和结合 力很大，利用通常的方法不能洗脱被吸附的目标产 物时，可利用脲或盐酸胍等变性溶液使目标产物发 生结构变化，失去与配基的亲和结合作用。但这些 变性剂容易使目标产物或固定化配基发生失活或不 可逆变性，需慎重使用。
利用清洗液清洗再生色谱柱
亲和配基－酶、抗体和蛋白

酶的抑制剂
蛋白酶均存在抑制其活性的物质，称为酶的抑制剂。它的分 布很广，有天然的生物大分子，如胰蛋白酶抑制剂（结合常 数为109 L/mol），也有小分子化合物如氨基苄脒（结合常数 为4×104 L/mol）。

抗体
抗体和抗原之间具有高度特异性结合能力，结合常数在107 ~1012 L/mol
其他亲和过程
-一次作用亲和沉淀原理

水溶性化合物偶联多个配基，蛋白质表面含
有两个以上亲和结合位点
源自文库
化合物与蛋白质因亲和作用产生亲和交联
交联形成的交联网络因分子量较大而沉淀
其他亲和过程
-二次作用亲和沉淀原理

利用在物理场改变时溶解度下降，发生可逆 性沉淀的水溶性聚合物为载体固定亲和配基， 制备亲和沉淀介质

组氨酸 肝素
肝素是存在于动物肝脏等器官中的酸性多糖类物质，分子量 为5到30kDa，它与凝血蛋白质、脂蛋白等有亲和作用。
亲和色谱
-亲和色谱介质应满足条件


具有亲水性多孔结构，无非特异性吸附；
物理和化学稳定性高，有较高的机械强度 含有可活化的反应基团 粒径均一的球形粒子
介质的活化方法－溴化氰法

蛋白A（或称A蛋白）
A蛋白为分子量42 kDa的蛋白质，存在于金黄色葡萄球菌的细 胞壁中。它与动物免疫球蛋白G（IgG）具有很强的结合作用。
亲和配基－凝集素和色素

凝集素
凝集素是与糖特异性结合的蛋白质的总称。在这种蛋白质上 具有糖的结合位点。可作为多糖、糖蛋白等含糖生物分子的 配基。

辅酶和磷酸酰苷

其他亲和过程
-亲和反胶团萃取
亲和反胶团是指在反胶团相中除通常的表 面活性剂以外，添加另一种亲水头部为目 标分子的亲和配基的助表面活性剂，通过 亲和配基与目标分子亲和作用，促进目标 产物在反胶团相分配。
其他亲和过程
-亲和沉淀定义
亲和沉淀是生物亲和作用与沉淀分离 相结合的蛋白质类生物大分子的分离技 术，包括一次作用亲和沉淀和二次作用 亲和沉淀。

料液流速
流速的增大，分离速度加快，但柱效降低
亲和色谱
-目标产物的特异性洗脱
特异性洗脱利用含有与亲和配 基或目标产物具有亲和结合作用的 小分子化合物为洗脱剂，通过与亲 和配基或目标产物的竞争性结合， 脱附目标产物。特异性洗脱条件温 和，有利于保护目标产物的生物活 性。另外，由于仅特异性洗脱目标 产物，对于特异性较低的亲和体系 或非特异性吸附较为严重的物系， 特异性洗脱有利于提高目标产物的 纯度。