海带多糖的制备

海带多糖的制备

—第六组钱龙

A.背景

简介

(一)从海带属藻类中分离提取到的一些多糖，其中包括海带淀粉、海带胶、藻酸，还有岩藻聚糖等多糖类物质的总称。主要用于各种增稠剂、浆料、固定化酶的基质材料和有关色谱分离基质材料。

(二)又称海带胶。分为两种类型，即可溶于冷水的可溶性海带胶和不溶于冷水而易溶于热水的不溶性海带胶。经0.05mol/L HCl在135℃下完全水解，可得到含一分子结晶水的D-葡萄糖。两种海带胶组分都含有甘露糖醇，它与葡萄糖之比分别为1:57和1:37。其糖链结构被认为是以(1→3)- β-D-葡萄糖基为主链，含有少量(1→6)-β-D-葡萄糖苷键分支，有些链末端是β-(1→6)结合的甘露醇。不溶性海带胶可从昆布Laminaria cloustoni等中获得。分支度低于可溶性海带胶。92.5%多糖，0.4%非挥发分。旋光度-13.4°(c=0.9)。可溶性海带胶可从昆布L. digitata中分离获得。91.2%多糖，1.0%非挥发分。旋光度-11.9°(c=2.1)。

作用

可抗肿瘤、抗病毒、抗菌、消除自由基、抗氧化。褐藻糖胶（fucoidan，简称FPS）可治疗

分子式

慢性肾衰，对中早期肾衰效果好，无毒副作用，特别对改善肾功能，提高肾脏对肌酐清除率效果尤为显著，现已按国家二类新药获准进入临床研究抗疲劳作用抗高血脂凝血作用及其在心脑血管疾病中的应用降血糖作用放射防护效果（抗辐射作用）

特性

与金属离子的结合，褐藻糖胶可作为金属离子的结合剂和阻吸剂。对神经细胞生存的影响，褐藻多糖对海马神经细胞和皮质神经细胞均有明显的营养作用.对肺成纤维细胞增殖活性的影响.对血管平滑肌细胞增殖作用的影响其它一些临床用途，褐藻胶可用做安全有效的止血药；低泵糖褐藻酸钠可用做代血浆，是维持血容量的良好的扩容剂；褐藻酸钠还可用做人工牙模材；而PSS除了在心脑血管病中的应用外，还被广泛用于治疗眼睑黄色瘤、

突发性耳聋、系统性红斑狼疮、糖尿病性周围神经病变、不安腿综合征、新生儿硬化症及银屑病、积聚性痤疮、变态性血管炎、系统性硬皮病、静脉炎、结节性红斑、硬红斑、扁平苔癣等

B.制备

蛋白质、酶、核酸、多糖等生物大分子的结构与功能的研究是探求生命奥秘的中心课题。为了进行结构与功能的研究，首先必须解决制备问题，制备完毕要进行鉴定。

一、实验目的

1，掌握酶法提取海带硫酸多糖的原理和操作流程；

2，了解多糖物质的常规纯化方法及原理；

3，熟悉多糖含量测定的常用方法和原理；

4，掌握硫酸－蒽酮法测定多糖的原理及操作流程、注意事项；

二、实验原理

本实验综合利用细胞匀浆和纤维素酶水解，破碎海带细胞壁，释放细胞内容物，包括多糖、海藻酸以及蛋白、核酸等；随后通过海藻酸与Ca2+的结合沉淀形成不溶性海藻酸钙，以去除其中的海藻酸；继而通过CTAB与多糖络合后溶解度下降的特性，将多糖与其他成份分离；最后在盐溶液中回溶多糖，并通过乙醇沉淀法获得多糖沉淀，即为海带粗多糖。可采用硫酸－蒽酮法测定多糖的含量

三、实验材料及试剂

实验材料：干海带

实验试剂：氯化钾、1mol/L氯化钙溶液、硫酸、蒽酮、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、葡萄糖、)等

仪器：剪刀、水浴锅、台式高速离心机、分光光度计等

四、实验步骤

海带多糖的提取

1．干海带加水浸泡过夜，充分溶胀后，加入1/3体积的水，放入组研钵中，磨碎。取约100ml 海带浆，调PH值为4.5-5.0。

2．向滤液中加入1/4体积1mol/L氯化钙溶液，搅拌均匀后，抽滤，去除海藻酸钙。（这个时候过滤比较简单，因为海藻酸钙是絮状沉淀，易过滤）

3．于滤液中加入1/5体积的2%CTAB与海带多糖结合沉淀，12000rpm离心5min收集CTAB-多糖沉淀物。(1.要经过离心的两个管一定要配平，平行操作2.两个管相对放置3.离心参数设置4.记忆)

4．在CTAB-多糖络合沉淀物中加入0.5ml 2mol/L氯化钾溶液，通过盐解作用，溶解释放海带多糖，然后加入2倍体积无水乙醇沉淀多糖，12000rpm离心5min。

硫酸-蒽酮法测定海带多糖含量

1.配制硫酸-蒽酮试剂:取2g蒽酮溶解于1000ml浓H2SO4中，当日配制使用。（硫酸-蒽酮试剂对人体有很大的腐蚀性，这个操作是由几个学姐完成的）

2．绘制葡萄糖标准曲线:准确量取100μg/ml葡萄糖标准溶液0，0.10，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00ml，注入糖管中，补充纯水至1.00ml（下表）。并分别加入4.00ml硫酸-蒽酮试剂，盖塞后立即摇匀，迅速浸入冷水浴中，各管加完后一起置于沸水浴中10min，，封口防蒸发，取出流水冷却，室温放置10分钟，于620nm处比色，测定吸光度值。以测得的吸光度为纵坐标，标准葡萄糖含量为横坐标，作出标准曲线。（葡萄糖溶液接触硫酸-蒽酮试剂后立即放大量热，注意安全）（测吸光度的时候要先将两个比色皿配平，减少误差）

3．海带多糖含量测定:将海带粗多糖以适量水溶解（约为10-80ug/ml），并准确量取1.00ml 待测溶液，加入4ml硫酸-蒽酮试剂，同标准曲线之操作，比色测定。根据标准曲线计算糖含量。0.2ml—2ml（10倍）

0.2ml—2ml（10倍）

↓

1ml—2ml（20倍）

↓

1ml—2ml（40倍）

（这一步骤是在指导老师的指导下完成的，既不浪费样品又准确专业，因为一般生物方面的实验样品都比较少，必须注意节省用量，取总样品中的一部分即可，而且可以减少误差）

实验数据

五、注意事项：

1.海带细胞壁以纤维素为主，因此可用纤维素酶水解细胞壁破碎细胞，酶解作用温和，对于细胞内容物成分影响较小。

2.在海带多糖的提取过程中，海藻酸类物质是主要的杂质成分，本实验通过加入Ca2+与海藻酸结合成为不溶性的海藻酸钙沉淀，去除海藻酸，初步纯化多糖。

3.CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）是一种阳离子表面活性剂，在低离子强度的溶液中具有沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，而在高离子强度的溶液里，CTAB又可与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多糖形成复合物。因此，本实验利用了CTAB沉淀多糖的性质，将多糖与其他成份分离，且这种酸性多糖沉淀物可在一定盐浓度下被重新溶解而不引起其他性质的改变，可用于多糖的纯化

4.多糖中常含有大量羟基，极性较大，在水溶液中溶解性很好，而在低极性的有机溶剂（如乙醇）中溶解度较小，因此，向多糖溶液中加入乙醇，可降低水溶液的介电常数，使多糖脱水从而产生沉淀来浓缩多糖。