基于核酸适体与互补核酸和目标蛋白之间竞争反应的PDGF蛋白特异性识别

Vol．32

高等学校化学学报No．112011年11月CHEMICAL JOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES 2509 2514

基于核酸适体与互补核酸和目标蛋白之间

竞争反应的PDGF 蛋白特异性识别

郑静1，2，秦佳华1，龚晨1，黄焕1，何品刚2，方禹之

2（1．上海工程技术大学化学化工学院，上海201620；2．华东师范大学化学系，上海200062）

摘要报道了一种利用核酸适体与互补核酸和目标蛋白之间的竞争反应用于PDGF 蛋白的特异性识别方法．

采用反相微乳液技术制备了包覆有亚甲基蓝（MB ）的SiO 2纳米复合物（SiO 2-

MB ），利用固定在磁性纳米颗粒上的核酸适体与SiO 2-

MB 纳米颗粒标记的互补核酸进行杂交反应，将一定数量的SiO 2-MB 纳米颗粒固定于磁性纳米颗粒的表面，引入PDGF 目标蛋白后，利用核酸适体与互补核酸和PDGF 之间的竞争反应，通过检测MB 电化学信号的变化来检测PDGF．该方法对PDGF 蛋白具有很高的特异性识别能力，不受其它蛋白质

如免疫球蛋白G 、凝血酶和溶菌酶等的干扰．实验结果表明，PDGF 浓度在5.51ˑ10

－17 1.01ˑ10－15mol /L 范围内具有良好的线性关系，检出限可达1.31ˑ10

－17mol /L．关键词核酸适体；PDGF 蛋白；特异性识别

中图分类号

O657．1文献标识码A 文章编号0251-0790（2011）11-2509-06收稿日期：2010-

12-06．基金项目：国家自然科学基金（批准号：20675031）和上海市教委科研创新项目（批准号：09YZ374）资助．

联系人简介：郑静，女，博士，副教授，主要从事生物传感器、电化学及纳米材料等方面研究．E-

mail ：kkzhengjing707@163．com 随着人类基因组计划（HGP ）的顺利完成及蛋白质组学研究的启动，人类进入了后基因组时代，对

特定疾病标志蛋白的检测日益受到重视

［1 3］．血小板源生长因子（Platelet-derived growth factor ，PDGF ）是具有双链结构的蛋白多肽，是血小板分泌的主要丝裂原，在血凝过程中被释放出来，随血液循环而

行进并作用于间充质细胞

［4，5］．它能刺激成纤维细胞、平滑肌细胞及神经胶质细胞等细胞的DNA 合成和细胞的增殖，是这些细胞体外培养的重要有丝分裂原，在创伤愈合、组织修复及动脉粥样硬化的形

成中起主要作用

［6，7］；还能诱导成纤维细胞分泌基质成分和生长因子，如IGF-I ，HGF 和ET3等，这些生长因子能调节肿瘤生长和肿瘤微环境［8］，因此对PDGF 进行检测具有重要意义．目前，一般采用酶

联免疫吸附法检测PDGF

［9，10］，而基于免疫分析的方法具有抗体对外界温度敏感，活性保存期有限且固定时活性易受损等缺点．近年来，核酸适体（Aptamer ）技术已成为一种新型的蛋白质识别技术

［11，12］，基于核酸适体识别PDGF 蛋白的生物传感器和相应的诊断技术备受关注

［13，14］，已有利用荧光检测法［15 17］和电化学方法［18，19］等对PDGF 进行检测的报道．

纳米材料的优异性能为超灵敏分析检测带来了新的契机

［20 22］．磁性纳米颗粒在生物检测和药物分析上具有很大的应用潜力

［23，24］，利用磁性纳米颗粒良好的生物相容性和顺磁性来分离和富集样品，可极大提高生物传感器的灵敏度

［25 27］．二氧化硅以其良好的生物相容性、多孔性、无毒性、化学惰性、生物降解性及热稳定性，引起了人们的广泛关注

［28 30］．亚甲基蓝（MB ）是一种有机染料，具有很好的电化学响应．掺杂MB 的SiO 2纳米颗粒不仅具有良好的生物相容性，而且MB 分子（核）包埋于纳米SiO 2颗粒（壳）的三维网状结构中，有效地防止了MB 的流失，提高了电化学检测的灵敏度．

本文报道一种利用磁性纳米颗粒和掺杂MB 的SiO 2纳米颗粒，将基于竞争反应的核酸适体技术用于PDGF 蛋白的检测，原理如Scheme 1所示．将核酸适体固定在磁性纳米颗粒上，在互补核酸上标记SiO 2-MB 作为信标，在无PDGF 蛋白存在时，核酸适体与互补核酸杂交，将SiO 2-MB 带到磁性纳米颗粒的表面；引入目标蛋白后，核酸适体处于与互补核酸杂交和PDGF 蛋白特异性结合的竞争平衡反应中，

而核酸适体更倾向于与PDGF 结合［31］，通过检测MB 电化学信号的变化来检测目标蛋白．磁性纳米颗

粒不仅起到分离作用，而且可使检测物富集在电极表面，实现了对目标PDGF 蛋白的高灵敏检测．采

用SiO 2-

MB 纳米颗粒作为信标，MB 分子包覆在SiO 2的三维网状结构中，大大提高了检测的灵敏度，对PDGF 蛋白的检出限可达1.31ˑ10

－17mol /L．该方法灵敏度高，无需对PDGF 蛋白进行标记，特异性强，为PDGF 蛋白的检测提供了一种新的方法

．

Scheme 1Schematic representation of the aptasensor for PDGF

a ．Specific recognition for PDGF ；

b ．formation of the duplex structure．

1

实验部分1．1试剂与仪器

寡聚核苷酸片段由上海生工生物技术有限公司合成．带氨基的寡聚核苷酸（Aptamer ）：NH 2-

5'-CAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG-3'；带氨基的寡聚核苷酸（comDNA ）：NH 2-

5'-AAA-CAGGATCATGGTGATGCTCTACGTGCCGTAGCCTG-3'；带羧基的磁性纳米颗粒（平均粒径为100nm ，德国Chemicell 公司）；血小板源生长因子（PDGF ）、免疫球蛋白G （IgG ）、溶菌酶（Iysozyme ）、凝血酶（Thrombin ）、牛血清白蛋白（BSA ）和牛血红蛋白（Hb ）（Sigma 公司）；乙基［3-（二甲氨基）丙基］碳二亚胺盐酸盐（EDC ）（上海申能博彩生物制品有限公司）；三氯化铁、硫酸亚铁、咪唑、巯基乙酸、亚甲基

蓝、戊二醛、正硅酸四乙酯、曲拉通X-

100（OP ）和二亚乙基三胺（DETA ）（国药集团）；PBS （0.1mol /L NaCl 磷酸盐缓冲溶液，pH =7.3）；其它试剂均为分析纯；实验用水为超纯水（由Aquapro 公司超纯化水机制得）．CHI832型电化学分析仪（美国CHI 公司），玻碳电极为工作电极，Ag /AgCl 电极为参比电

极，铂丝为辅助电极；JEM-

100CX 型透射电子显微镜（TEM ，日本JEOL 公司）．1．2实验过程

1．2．1SiO 2-MB 纳米粒子的制备采用反相微乳液法，将3.8mL 环己烷、900μL 正己醇和900μL OP 混合均匀并搅拌30min ，然后缓慢加入200μL 1.04ˑ10－2mol /L MB 溶液，于室温下反应30min ，形成稳定的油包水体系．再缓慢地加入50μL 正硅酸四乙酯（TEOS ）和30μL NH 3·H 2O ，于室温下继续搅拌7 8h 后反应完成．向反应体系中加入适量乙醇，使纳米颗粒从油包水体系中分离沉淀出来，再以3000r /min 的速度反复离心，用乙醇洗涤沉淀数次，充分除去表面活性剂和纳米颗粒表面吸附的MB ，即得深蓝色的SiO 2-MB 纳米粒子．

1．2．2SiO 2-MB 标记寡核苷酸的制备

将新鲜合成的SiO 2-

MB 浸入新制的1%（体积分数）DETA 和1.0mmol /L 醋酸的混合溶液中，于室温下反应30min ，经DETA 修饰的纳米颗粒用醋酸充分洗涤，以

除去过量的DETA．将上述氨基修饰的SiO 2-

MB 纳米颗粒于37ħ下与5%（体积分数）戊二醛反应120min ，用蒸馏水洗涤数次以除去过量的戊二醛．然后加入1OD 氨基修饰的寡聚核苷酸（comDNA ），于37ħ水浴中搅拌反应120min ，使寡核苷酸连到纳米颗粒表面．产物经洗涤、离心后悬浮于PBS 缓冲溶液（pH =6.8）中，于4ħ下低温保存．

1．2．3在磁性纳米颗粒上固定核酸适配体将500μL 带羧基的磁性纳米颗粒用PBS 缓冲溶液洗涤3次，然后加入4.3mg 咪唑，超声30min．将5'端带氨基修饰的核酸适配体（1OD ）溶于500μL PBS 缓冲溶液（pH =7.3）中，加入4.6mg EDC 和羧基磁性纳米颗粒的咪唑溶液，于室温下反应8h．在磁场下分离，用500μL PBS 溶液洗涤3次，除去未反应的核酸适体，将固定有核酸适体分子的磁性纳米颗粒分散于500μL PBS 溶液中，于4ħ低温下保存．0152高等学校化学学报Vol．32