植物体内转化酶活性的测定

实验五植物体内转化酶活性的测定

转化酶又称蔗糖酶(β—D—呋喃型果糖苷一果糖水解酶)，是一种水解酶。植物体的库组织中，一般含有较高活性的转化酶。它能将植物体内的主要同化产物——蔗糖不可逆地水解为葡萄糖和果糖，为细胞的可溶性糖类贮库提供可利用六碳糖，以用于细胞壁、贮藏多糖及果聚糖的生物合成，并通过与呼吸作用偶联的氧化磷酸化产生能量。所以，转化酶与植物组织的生长有密切关系，是衡量同化产物的转化和利用，植物细胞代谢及生长强度的指标。

【原理】

转化酶可将非还原性糖的蔗糖水解为葡萄糖和果糖。将从植物组织中提取的酶液与蔗糖溶液保温作用一定时间后，测定产生的还原糖的量来表示转化酶活性的大小。

在碱性条件下，还原糖与3,5-二硝基水杨酸共热，3,5-二硝基水杨酸被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色物质)，还原糖则被氧化成糖酸及其它产物。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度量呈一定的比例关系，在540nm波长下测定棕红色物质的消光值，查对标准曲线可求出样品中还原糖的含量。

通常，在测定过程中，溶液的pH对酶活性影响很大。不同的酶及不同材料中同一种酶都有其最适的pH值。转化酶有两个影响水解蔗糖能力的解离基团，一个PKa约为7，另一个PKa约为3。不同植物材料的转化酶中这两个基团的含量不同，它们的最适pH也不同(最适pH在7.0左右的为中性转化酶，最适pH

在7.0以下的为酸性转化酶)。所以，在测定材料中转化酶的活性之前，首先要选择适宜的PH值。如冀棉2号棉铃中纤维和种子部分的转化酶活性的最适pH

为3.5～4.0。

而本实验所选择的材料一棉花叶片中转化酶的最适pH为 6.0。

【材料、仪器与试剂】

1．材料：棉花叶片

2．试剂，10％蔗糖溶液；葡萄糖标准液(500μg／ml)，0.05mol／L pH6.0的磷酸缓冲液；3，5—二硝基水杨酸：将6.3g二硝基水杨酸和262ml 2mol／L NaOH 溶液，加到500ml含有185 g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g

亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至l 000ml，贮于棕色瓶中备用。

3．设备

研钵﹑容量瓶(100ml) ﹑台式离心机﹑20ml刻度试管﹑恒温水浴锅﹑分

光光度计﹑移液管

【方法与步骤】

1．酶的提取：1 g样品剪碎后，用预冷的蒸馏水在冰浴中研磨成匀浆，定容至100m1，在冰箱中浸提3h，4000rpm离心15min(离心机型号LDZ 5—2)，上清液即为酶的粗提液。

2．酶活性的测定：吸酶液2ml，放入试管中，再加入pH 6.0的缓冲液5ml 及10%蔗糖溶液1ml，在37℃水浴锅中保温0.5h，取出后立即按3，5—二硝基水杨酸法测定还原糖的含量(见下步)。以煮沸酶液10min钝化酶的试管作对照。

3．还原糖标准曲线的制作及还原糖含量的测定

（1）制作标准曲线：取6支20ml刻度试管，编号，按下表配置不同浓度的

5min，取出后立即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温，加蒸馏水定容至20ml，混匀，以1号管为空白，测540nm波长下的OD值。以OD值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线。

（2）酶反应液中还原糖含量的测定；吸取2ml反应液，加入1.5ml 3，5—二硝基水杨酸试剂，沸水浴中煮沸5min，冷却定容至20ml，测定540nm处的OD 值。查标准曲线得酶反应液中还原糖的浓度。

【结果与计算】

转化酶的活性用还原糖量(mg／g·fw·h)表示，计算公式如下：

A表示转化酶的活性(mg／g·fw·h)，

N表示酶反应液中还原糖的浓度(μg／ml)，

N﹨表示钝化酶反应液中还原糖的浓度(μg／ml)，

V表示酶反应液的总体积，

T表示反应时间，

W表示材料鲜重。

转化酶的测定

转化酶又称蔗糖酶，是一种水解酶，植物体的库组织中，一般含有较高活性的转化酶，它能将植物体内的主要同化产物——蔗糖不可逆的水解为葡萄糖和果糖，为细胞的可溶性糖贮库提供可利用六碳糖，以用于细胞壁、贮藏多糖及果聚糖的生物合成，并通过与呼吸作用偶联的氧化磷酸化产生能量，所以，转化酶与植物组织的生长有密切关系，是衡量同化产物的转化和利用、植物细胞代谢及生长强度的指标。

试剂：

1、10%蔗糖溶液

2、葡萄糖标准液（500μg/ml）

3、0.05mol/l的磷酸缓冲液

4、（DNS）3，5二硝基水杨酸：将6.3g二硝基水杨酸和262 ml 2mol/l NaOH溶液，加到500ml含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000ml，贮于棕色瓶中备用。

方法：1、酶的提取：1g样品剪碎后，用预冷的蒸馏水在冰浴中研磨成匀浆，定容至100ml，在冰箱中浸提3小时，4000转离心15分钟，上清液即为酶的粗提液。

2、酶活性的测定：吸酶液2ml，放入试管中，再加入pH6.0的缓冲液5ml及10%蔗糖溶液1ml，在37度水浴中保温30分钟，取出后立即按3，5二硝基水杨酸法测定还原糖的含量。以煮沸酶液10分钟钝化酶的试管作对照。

3、还原糖标准曲线的制作及还原糖含量的测定

①标准曲线：取6支20ml刻度试管，编号，按下表配置不同浓度的葡萄糖标准液：

葡萄糖原液量（ml）0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0

加蒸馏水量（ml） 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0

葡萄糖浓度（μ

0 100 200 300 400 500

g/ml）

在上述各管中分别加入1.5ml 3，5二硝基水杨酸试剂，在沸水浴中加热5分钟，取出后立即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温，加蒸馏水定容至20ml，混匀，以1号管为空白，测540nm 波长下的OD值。以OD值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线。

②酶反应液中还原糖的含量的测定：吸取2ml反应液，加入1.5ml 3，5二硝基水杨酸试剂，沸水浴中煮沸5分钟，冷却定容至20ml ，测定540nm波长下的OD值，查标准曲线得酶反应液中还原糖的浓度。

4、结果计算：

A=(N-N’)*V/(T*W*1000)

A：转化酶的活性(mg/gfw/h) N：酶反应液中还原糖的浓度(μg/ml) N’：钝化酶反应液中还原糖的浓度(μg/ml) V：酶反应液的总体积

T：反应时间W：材料鲜重