兽医公共卫生-国内口蹄疫流行毒株及疫苗研究进展

O1BFS亚型FMDV株衣壳上的抗原位点分布
(FRY E E, et al. Journal General Virology, 2005. )
1. 亚单位疫苗
利用DNA重组技术，将编码病原微生物的抗原基因导入受体菌或细胞， 使其在受体中 高效表达出蛋白，提取纯化后，加入佐剂制成的疫苗。
焦颖等利用毕赤酵母系统表达O型FMDV VP1基因，并用酵母表达的VP1蛋白免疫小鼠， 然后通过ELISA检测抗体水平。结果表明，酵母所表达的VP1蛋白能诱导小鼠产生特异性体 液免疫应答。
我国主要商品化口蹄疫疫苗（猪用）
1. 猪口蹄疫O型、A型二价灭活疫苗（Re ～ O/MYA98/JSCZ/2013 株 +Re ～ A/WH/09 株 ）。 2. 猪口蹄疫O型灭活疫苗（O/ MYA98/BY/2010 株）。 4. 猪口蹄疫O型合成肽疫苗 （多肽 2600+2700+2800）。 3. 猪口蹄疫O型灭活疫苗（O/ Mya98/XJ2010 株 +O/GX09 ～ 7 株 ）。 5. 猪口蹄疫O型合成肽疫苗（多肽 98+93）。 6. 猪口蹄疫O型合成肽疫苗（多肽 TC98+7309+TC07）。 7. 猪口蹄疫O型合成肽疫苗（多肽 2570+7309）。 8. 猪口蹄疫O型病毒3A3B表位缺失灭活疫苗（O/rV ～ 1 株）。 9. 猪口蹄疫O型灭活疫苗 （OZK/93 株）。 10. 猪口蹄疫O型灭活疫苗 （OZK/93 株 +OR/80 株 ）。
源自南亚的毒株： O 型亚泛基因型（O/PanAsia） 毒株，早先在1999 年 前后传入我国，于2011 年再次经由东南亚传入我国。
东南亚- 东亚区域循环毒株：
O/CATHAY 毒株，最早确定于1970 年，在东南亚- 东
亚流行和变异，主要危害猪 。
外来口蹄疫主要流行毒株及可能传入的路线
造成巨大的经济损失和政治影响。
2017年下半年 口蹄疫全球分布情况 2018年上半年 口蹄疫全球分布情况
2018年12月 口蹄疫发病报道情况 来源：0IE
近年来，口蹄疫在亚洲和非洲 流行频繁，部分国家和地区疫情严 重。北美洲、大洋洲和大部分欧洲 地区持续保持无FMD 状态，南美中 东部地区为免疫无疫状态。
• 位点 1 位于 VP1 的 G-H 环和 C 末端，G-H 环是主要的抗原位 点，能够诱导高水平中和抗体，关键氨基酸是第 144 位、 148 位和 158 位，C 末端的关键氨基酸是第 208 位；
这些抗原位点的确定为抗原表位的选择提供了 理论依据，其中 VP1 上 G-H 环是重要的中和表位， 能够引起高水平的中和抗体，历来都是表位设计的 首选优势表位。
缺点：接种活载体疫苗后可能会因对载体病原产生相应的免疫力，干扰目的病原基因的表 达，还可能ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ成目的基因的丢失。
6 病毒样颗粒疫苗
病毒样颗粒疫苗是由病毒体外表达的一个或多个病毒蛋白，自动组装而成的空心颗粒，外 形与天然病毒粒子相似，不含病毒核酸，不能复制， 具有很强的免疫原性，可作为免疫原 ， 安全性好，无感染性，能诱导机体的免疫系统产生免疫保护反应。
猪口蹄疫 O 型、A 型 二 价 灭 活 疫 苗 （Re-O/MYA98/JSCZ/2013 株 +Re-A/WH/09 株）
Re-A/WH/09 株是利用高复制力型的 3'UTR 和 3D 基因构建了制苗种毒拯救框架，同时对 A 型 Sea-97 毒株结构蛋白 P1 基因进行突变修饰，改变了影响病毒 结构稳定性的关键氨基酸编码，并将其克 隆至上述病毒 拯救框架，制备出 Sea-97 株重组病毒 Re-A/WH/09；
缺点：亚单位苗与全病毒疫苗比免疫原性差，需经多次免疫才能获得有效保护。
2. 核酸疫苗
将病原基因克隆入真核表达载体上，经筛选后，获得正确的重组质粒，免疫动物后，外 源病原基因可在动物机体表达，激活针对该病原的免疫应答反应，这类疫苗称为核酸疫苗。
王晓虎等构建了单独含 FMDV VP1、 VP4基因及同时含两种基因的的重组核酸疫苗，将3 种核酸疫苗免疫动物后，检测免疫原性，结果显示，这3 种疫苗质粒均能刺激机体产生中和 抗体，且具有一定的保护效力。VP1单表达组和联合组保护率均为28.6%， 共表达组和融合表 达组保护率均为 42.9%，灭活疫苗组保护率为100%， 空载体组保护率为0。
国内口蹄疫流行毒株及疫苗研究进展
专业：预防兽医学 学号： 汇报人：
概述
口蹄疫是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的偶蹄兽的 急性高度接触性传染病, ，可感染猪、牛、 羊等 70多种动物 ；
FMD传染性极强，且能以气溶胶的形式远距离传 播，一旦发生，往往造成大范围流行；
死亡率只有2~3%，犊牛及仔猪和恶性病例死亡 率可达50~100%。
预防和控制口蹄疫的策略
跟踪毒株：
确定和跟踪高危外来毒株的流行和传播动向，开展风险分析，及时预警。
边境监测：
完善监测体系，持续开展高风险边境地区监测，严厉打击走私行为。
疫苗评价和技术储备
预防和控制口蹄疫的策略
西欧和南美的一些国家采用疫苗免疫和扑杀的措施 成功地净化和消灭了 FMD。 我国预防控制口蹄疫 计划采用“免疫无疫”到“无疫”的梯度推进建设模式， 主要依赖疫苗的综合防治措施。
缺点：核酸疫苗长期使用后可能产生DNA抗体，对动物机体产生不良影响。
3. 合成肽疫苗
合成肽疫苗是通过人工合成保护性多肽，并将其连接到大分子载体上，加入佐剂而制 成的疫苗。
唐华等应用两种不同浓度的含 AF/72 株 FMDV VP1[131-159]、 VP4[20-35]、3A [21-35] 和 3B[29-42]4个抗原表位的合成肽联合 CpG寡聚脱氧核苷酸(5’-TCGCGAACGTTCGCCCGATCGTCGGTA-3') 合成肽疫苗365和364在豚鼠上进行了免疫效力评价，并设置灭活疫苗免疫组和PBS对照组。结果显示， 2.5μg/ 只的合成肽364能保护4/5的豚鼠免受 FMDV AF/72 株的攻击，灭活苗组 获得完全保护，其他组 的保护效力仅为3/5，保护效力最高的两组的外周血CD4+T淋巴细胞含量高达33.7% 和 36.6%，而其他组 不超过 27.7%， PBS组仅为18.1%。
缺点：合成肽疫苗容易被细胞内的蛋白酶所降解，并且抗原位点也不一定能被所有的宿主 动物识别，免疫原性较弱，使用效果并不理想。
4 表位疫苗
表位疫苗是指利用基因工程方法体外表达或人工合成病原微生物的抗原分子表位，将 其作为抗原研制成的疫苗。
高明等取O型FMDV 3个毒株 VP1蛋白的优势表位，设计并合成重复串联表位基因3FoEN2，并克隆 猪IgG重链恒定区基因。将2个基因依次克隆到pProEX-HTb载体，将获得的重组质粒转化感受态细胞大 肠杆菌BL21,诱导后， 经鉴定获得目的蛋白表达。分别用5 种佐剂ISA206、ISA201、IMS1313、 603、 ISA61 乳化融合蛋白配制疫苗免疫BALB/c雌鼠，并检测免疫效果。 结果显示，重组蛋白能与感染O型 FMDV的猪的阳性血清发生特异性免疫反应，ISA201佐剂试验组刺激机 体产生的抗体水平最高。
自 2008 年以来，外来口蹄疫病 毒高频率、强穿透力传入我国，给 我国养殖业造成巨大危害。据农村 农业部疫情发布，2018年，我国新 疆、甘肃、河南、湖北、贵州等地 已先后发布20余起口蹄疫疫情。
FMDV 包括 7 个血清型: A型、O型、C型、SAT 1、SAT 2、SAT3和 Asia 1型，80多个亚型。 近年来，我国主要流行毒株为 O 型和 A 型（ A/Sea-97），其中 O 型为复杂，包括中国 Cathay 拓扑型、 Mya98 基因型、O/PanAsia泛亚基因型和 Ind2001 基因型；
局限性：表位疫苗还需要就FMDV抗原位点演变与表型间的关系进行深入研究。
5 活载体疫苗
将外源病原基因插入到已经弱毒的活病毒或通过特定的质粒导入无毒力的细菌体内， 免疫动物后， 外源病原基因可在动物体内表达， 这类疫苗称为活载体疫苗。
王淼等构建了能表达 A 型 FMDV VP1基因的重组乳酸杆菌 pSIP411-VP1-NC8和pSIP411VP1WCFS1，将获得的重组乳酸杆菌分别免疫豚鼠以检测免疫效果，并设置空质粒对照组pSIP411NC8、pSIP411WCFS1和阴性对照组，结果显示，两组重组乳酸杆菌免疫组抗体水平明显高于其他3组， 差异显著，CD4+、 CD8+淋巴细胞含量明显增多，脾淋巴细胞在抗原刺激后增殖明显，可在血清中检 测到中和抗体。
新近传入毒株： O 型印度2001（O/Ind-2001）毒株，O/Ind-2001 毒株起源于南亚次大陆，新近由境外传入我国，2017 年在新疆 引发疫情，2018 年，该毒株先后在湖北、安徽、贵州等省份再次发生疫情。
有传入风险毒株
➢ O/PanAsia-2、A/Iran-05 和 Asia1/Sindh-08 等毒株常 年流行于中东-西亚地区的阿富汗、伊朗、巴基斯坦、 土耳其等国。多来自于南亚，传播至中东-西亚后形 成变异株 。
董艳美等根据猪源FMDV VP1上第141~160位氨基酸序列设计引物， 利用重叠延伸PCR技术将该序列 插入到大肠 杆菌噬菌体MS2外壳蛋白基因的特定位点。 然后连接到原核表达载体pET28a上，转化BL21诱 导表达得到融合表达的CP-VP1蛋白。间接ELISA实验证实，该蛋白能够特异地结合豚鼠抗O型FMDV的阳性 血清， 30μg的CP-VP1的VLPs蛋白免疫小鼠后， 可以诱导其产生高效价的特异抗体。
➢ A/G-VII（G18）毒株 该毒株长期在印度次大陆地区 流行。从 2015 年起， 突然在沙特阿拉伯、土耳其、 伊朗和阿曼尼亚等国连续引发疫情，表现出强劲的传 播力。
➢ Asia1 型 G VIII 群毒株 2017 年初，缅甸发生Asia1型 FMD 疫情。
全球口蹄疫流行圈和血清型分布 来源：OIE
近年来我国开展了一系列新疫苗和疫苗新技术研究, 包括FMD反向遗传疫苗、标记疫苗、 复合表位蛋白疫苗、病毒样颗粒疫苗等, 取得了一定的进展。
研究表明， A型、O 型、C 型 FMDV 的核酸序列 大约有 86%的序列相同，A 型和 C 型 FMDV 的抗原 大致类似于 O 型。
O 型 FMDV 至少有 5 个抗原位点：
对我国形成威胁的外来口蹄疫病毒 主要来自东南亚、南亚和西亚- 中东等 地区。
该 3 个区域是目前全球 FMD 疫情 发生最为频繁的地区，主要流行O型、 A 型和Asia1 型 。
全球口蹄疫流行圈和血清型分布 来源：OIE
外来流行毒株与传入路线
（何继军等，中国动物检疫，2018）
源自东南亚毒株： A 型东南亚97（A/Sea97）毒株G1 分支和G2 分支， 分别于2009 年和 2013 年传入我国；O 型缅甸 98 （O/Mya-98）毒株， 于 2010 年传入我国 。
缺点：病毒样颗粒疫苗不易制备。 可饲疫苗抗原蛋白的表达量较低。
7 基因缺失 / 标记疫苗
采用基因工程技术将病原毒力基因缺失，从而使病毒毒力减弱，制成的疫苗免疫 动物后，无毒性，只有免疫原性，称为基因缺失疫苗。
袁红等为研制针对我国边境地区(尤其是西南边境)流行的A型FMD的标记疫苗储备病毒株， 构建了含A型FMD疫毒P1基因的O型FMD的嵌合型质粒 pO/3A91-105-AP1，Not Ⅰ酶切线性化后 转染BSR/T7细胞，拯救得到FMDV重组病毒。 间接免疫荧光、RT-PCR和序列测定结果表明拯救 的FMDV 为正确的A型和O 型间嵌合及 3Aaa91-aa105缺失的重组病毒。病毒蚀斑和一步生长曲 线表明拯救病毒的感染性和复制能力稍低于其亲本病毒。该型间嵌合标记病毒的成功拯救为研制 防控边境地区A型FMD的储备疫苗奠定了基础。
Re-O/MYA98/JSCZ/2013株是在成功构建A型疫苗种毒的基础上，利用制苗种毒拯救框架对O型 Mya-98病毒进行了改造和提升，制备出针对O/Mya-98株的重组病毒 。
已于 2017 年 12 月 11 日获得 “一类新兽药注册证书”。该疫苗对我国当前流行的口蹄毒株 （ A/Sea-97、Cathay 拓扑型、Mya98 、O/PanAsia、O/Ind-2001）均有效，是我国目前防控口蹄疫首 选的疫苗。