2012年酵母蔗糖酶的提取、分离纯化及其蛋白质浓度和酶活力测定(12.6)

本实验提取纯化的主要是外蔗糖酶
酵母细胞结构图
酶是生物体内具有催化活性的物质，可据酶 蛋白的结构和性质来选择分离提纯方法和含量 测定。 酶的分离提纯是为了提高纯度（或比活力） 及收率；依据其性质（分子大小、溶解度、电 荷、吸附等）进行分离; 同时用测定酶活力的 方法了解酶的去向、衡量酶提纯的程度和得率。
实验十
酵母蔗糖酶的提取、分离纯化及其 蛋白质浓度和酶活力测定
蔗糖酶催化底物蔗糖分解成葡萄糖和果糖 蔗糖酶在酵母细胞中存在着两种形式 :

存在于细胞膜外细胞壁中的高度糖基化的外蔗糖酶，其活 力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50％（质量分数）糖成 分的糖蛋白，该酶是蔗糖酶的主要形式

存在于细胞膜内侧细胞质中的低糖基化的内蔗糖酶。
对照 1
粗酶液1 2 2000倍 0.6
醇级分2 3 5000倍/ 10000倍 0.6
葡萄糖对照 5
葡萄糖 6
0.6 0.2 0.2 0.2
1
0.8
0.2 0.2 0.2 0.2
加入蔗糖，立即摇匀开始计时，室温准确反应10min后，立即加碱性铜试剂终止反应。 碱性铜试剂/ml 1 1 1 1 1
立即用90－95℃水浴加热7－8min，立即用自来水冷却。
分实验三：蔗糖酶各级分的蛋白含量测定 （G-250法）
实验目的 实验原理 仪器 试剂 方法 波长为595nm
1.标准曲线的制作（选用0.5cm比色皿 ）
样品
管号 试剂
牛血清标准蛋白溶液 （ml） 100µg/ml 考马斯亮蓝（ml） 蒸馏水（ml） 蛋白质浓度（µg/ml）
0
1
2
3
4
5
粗酶 液1
（μmol / min×mL）
式中： A650nm ──第2,3,4管所测A650 A′650nm──第6管所测A650 0.2 ── 第6管葡萄糖取样量 2 ── 标准葡萄糖浓度2mmol/L = 2μmol/ml 10 ──反应10min B ──每管加入酶液mL数 原始酶液的酶活力 E = (E′/2)×稀释倍数
四、仪器
试管、试管架、移液管、分光光度计、
比色杯、水浴锅等
五、酶活力测定的步骤
1.粗酶液1 ，醇级分2 酶活力测定
（1）首先用去离子水稀释粗酶液1： 2000倍， 醇级分2： 5000、10000倍，（可取0.1mL加入
25ml刻度试管，定容25mL，即稀释250倍）
各管名称 管数 稀释倍数 酶液/ml 水/ml HAC-NaAC缓冲液 2mmol/L葡萄糖/ml 0.2mol/L蔗糖/ml
磷钼酸试剂/ml
水/ml A650nm E′=μmol/min.ml 原始酶液酶活力E单位/ml
1
5
1
5
1
5
1
5
1
5
(波长：650nm)
一个酶活力单位Units定义为在给定的实验条件下，
每分钟能催化1μmol蔗糖水解所需的酶量
比活力，每mg蔗糖酶所具有的酶活力单位
稀释后酶液的活力(按还原糖计算)： A650nm×0.2×2 E′= A’650nm×10×B
荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改
变pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来 。
三、试剂
阴离子交换剂 DEAE 0.02 mol/L pH7.3 Tris-HCl缓冲液 0.02 mol/L pH7.3 Tris-HCl缓冲液（含1 mol/L NaCl） 0.02 mol/L pH7.3 Tris-HCl缓冲液（含2 mol/L NaCl）
本实验由四个分实验组成：
蔗糖酶的提取与初步纯化 蔗糖酶各级分酶蛋白质浓度的测定 蔗糖酶各级分酶活力的测定 离子交换柱层析纯化蔗糖酶
分实验一：蔗糖酶的提取与初步纯化
一、实验目的

学习蔗糖酶分离提取的原理

学习掌握细胞破壁、有机溶剂沉淀蛋白质的原
理与操作
二、实验原理
机械法
细胞破碎的方法
高压匀浆破碎法（homogenization） 振荡珠击破碎法 (Skaking Bead)
分转入水相中。
（4）平衡，4℃、10000rpm离心10min （5）将上清液倒入量筒，量出体积并记录，转入清洁烧杯中。 （6）用pH试纸检查上清pH值，用1mol/L 乙酸将pH值调至5.0。 （7）将其置于50℃的水浴，经常缓慢搅拌，30min。 （8）于冰浴中迅速冷却，倒入100ml的离心管中，4℃，离心 10分钟。 （9）取上清液，量体积并记录，得粗酶液1，同时预留2.0 ml 测定用。
质分子上不同电荷的引力，降低其溶解度，因
此使之发生沉淀反应。如把溶液的pH 值调节到 该蛋白质的等电点时，则沉淀更完善。 在室温条件下，有机溶剂沉淀所得蛋白质 往往已发生变性。 若在低温条件下进行沉淀， 则变性作用进行缓慢。
利用机械法（二氧化硅研磨）破碎酵母细胞壁
采用预冷的去离子水溶解破壁后释放出来的蔗糖酶
级 分
Ⅰ Ⅱ Ⅲ
记录体 积/ml
校正体 积/ml
蛋白质 /mg/ml
总蛋白 量/mg
酶活 Unit
总酶活 力 Unit*V
比活/ Unit/mg
纯化 倍数
1.0
回收 率％
100
蛋白总量 = 蛋白浓度×总体积 总酶活 = 酶活×校正体积 比活力（Unit/mg）＝总酶活力/总蛋白 纯化倍数 = 比活力之比 回收率 = 总酶活之比
高速搅拌珠研磨破碎法（fine grinding）
超声波破碎法（ultrasonication） 渗透压冲击破碎法（osmotic shock） 冻融破碎法（freezing and thawing）
非机械法
酶溶破碎法（enzyme lysis） 化学破碎法（chemical treatment）
去垢剂破碎法（detergents）
在酸性条件下，蔗糖酶催化蔗糖水解，生成葡萄糖和果糖。
葡萄糖、果糖和碱性铜试剂混合加热后被其氧化，二价铜
被还原成棕红色氧化亚铜沉淀。
氧化亚铜与磷钼酸作用生成蓝色溶液，其蓝色深度与还原
糖的量成正比，于650nm测定光吸收值。
三、试剂
碱性铜试剂
磷钼酸试剂
葡萄糖标准溶液
0.2mol/L蔗糖溶液
0.2mol/L乙酸缓冲液，pH4.9
离心去除酵母菌体而得到蔗糖酶溶液
加热去除热不稳定的杂蛋白
乙醇沉淀获得粗提酶。
三、实验材料、仪器和试剂
实验材料：安琪酵母
仪器和试剂:
研钵，离心管，滴管，量筒，恒温水浴锅，烧杯， 高速冷冻离心机， pH值试纸 二氧化硅，去离子水，冰，食盐，1mol/L乙酸， 95％乙醇.
四、操作步骤
提取
（1）准备冰浴，将研钵稳妥放入冰浴中 （2）称取3g干酵母粉和5g 二氧化硅(石英砂)，放入研钵中 （3）用量筒量取30mL预冷的去离子水，先加5ml左右研磨 （若不够每次用滴管再加2mL左右水）， 边加边研磨成糊状 （至少用30 min），然后转移到100mL离心管中,最后用剩余 的水洗净研钵中的物质并转移到离心管中，以便将蔗糖酶充
蛋白质的沉淀
蛋白质从溶液中以固体状态析出的现象
作用机制主要是破坏了蛋白质水化膜或蛋白 质所带的电荷
主要沉淀方法：
盐沉淀蛋白质——盐析
重金属盐沉淀蛋白质 某些酸类沉淀蛋白质 有机溶剂沉淀蛋白质
乙醇、甲醇、丙酮等有机溶剂可破坏蛋白
质的水化层，使蛋白质的溶解度下降；另一方
面有机溶剂能降低溶液的介电常数，增加蛋白
定。
分实验二：蔗糖酶各级分酶活力的测定 一、实验目的
掌握蔗糖酶活力测ห้องสมุดไป่ตู้方法
二、实验原理
蔗糖酶能催化非还原性双糖(蔗糖)的1,2-
糖苷键裂解，释放出等量的果糖和葡萄糖。每
摩尔蔗糖水解产生两摩尔还原糖，蔗糖的裂解
速率可以通过斐林试剂法测定还原糖的产生数
量来测定。
蔗糖 葡萄糖
果糖
蔗糖酶
+
斐林试剂法测还原糖含量灵敏度较高，其原理是：
乙醇沉淀
将粗酶液1转入小烧杯中，放入冰盐浴（碎冰、撒入少量 食盐），逐滴加入等体积-20℃预冷的95%乙醇，同时轻轻搅 拌，共需30min；再在冰盐浴中放置10 min，使沉淀完全。 4℃、 10000 rpm离心10min，弃上清，并滴干，记录为“醇级
分2”，用5mL去离子水溶解后用于蛋白质含量和酶活力的测
值降低稳定后，可用恒流泵及梯度混合器进行梯度
洗脱 [梯度混合器左侧放入50ml 0.02 mol/L pH值
为7.3的Tris-HCl缓冲液（含1 mol/L NaCl），
右侧放入等量0.02 mol/LpH值为7.3的Tris-HCl
缓冲液]。
连续收集洗脱液，注意观察紫外检测仪的读值，注意 标记其升高时对应的收集器中的试管，待蛋白峰过后 A280nm值稳定后，记住标记此时对应的收集器中的试管 。
最后用0.02 mol/L pH值为7.3的Tris-HCl缓冲液
（含2 mol/L NaCl）洗层析柱，洗去所有吸附在柱
子上的物质。
分组：
3人一组
分实验四：离子交换柱层析纯化蔗糖酶
一、实验目的 学习掌握离子交换柱层析的原理与操作
二 、实验原理
离子交换是指液相中的离子与固相交换
基团中的离子可逆反应。离子交换剂有阳离子
交换剂（如：羧甲基纤维素：CM-纤维素）和阴 离子交换剂（如：二乙氨基乙基纤维素： DEAE-纤维素），当被分离的蛋白质溶液流经 离子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电
醇级 分2
（50X） （50X）
柱级 分
0 2.5 1.0 0
0.2 2.5 0.8 20
0.4 2.5 0.6 40
0.6 2.5 0.4 60
0.8 2.5 0.2 80
1.0 2.5 0 100
1.0 2.5 0 未知
1.0 2.5 0 未知
计算：
1.计算并比较粗酶液I，醇级分II，
获得的蔗糖酶的蛋白总量，及酶活力, 并分析原因。 2. 各级分的纯化回收计算：
2. 上样与洗脱
首先将前次实验放在-20℃的醇级分2取出，用5 mL
0.02 mol/L pH值为7.3的Tris-HCl缓冲液稀释，混匀，
4℃，10000rpm离心5min,取1.5ml用于测定。
将2-3mL醇级分2用移液管沿着管壁轻轻加到
层析柱中，注意不要扰动柱床，上样后，用大约
30ml缓冲液洗去柱中未吸附的蛋白质，当A280nm
四、仪器
层析柱
部分收集器 磁力搅拌器及搅拌子 梯度混合器 紫外检测仪 紫外记录仪 真空泵与抽滤瓶 精密pH试纸或pH计
五、操作步骤
1. 装柱与平衡
将层析柱垂直装好，将DEAE 引流装柱，然后用0.02 mol/L pH 7.3的Tris-HCl缓冲液洗柱，直至流出液的电导率与缓冲液 相同或接近时，稳定后即可上样。 注意层析柱中不能有气泡，否则要重装