栀子双波长融合高效液相色谱数字化指纹图谱研究

栀子双波长融合高效液相色谱数字化指
纹图谱研究
（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）
【摘要】目的采用双波长融合法建立栀子254 nm和326 nm波长下的融合HPLC指纹图谱。

方法采用反相高效液相色谱法，使用CenturySIL C18 BDS柱(20 cm×4.6mm，5μm)，以1%醋酸水-1%醋酸乙腈为流动相，低压线性梯度洗脱，柱温（30.0±0.15）℃，采用DAD检测器同时采集2个特征吸收波长下的信号，测定10批不同产地栀子HPLC指纹图谱。

结果用“中药色谱指纹图谱超信息特征数字化评价系统”软件建立了栀子254 nm和326 nm的双波长融合HPLC指纹图谱，以栀子苷为参照物，确定了41个共有峰，并对其进行了全面评价。

结论所建立的双波长融合谱能有效控制栀子的质量，克服了单波长检测时信息量有限的缺点，能较全面、真实地揭示中药材的内在质量特征。

【关键词】栀子；高效液相色谱数字化指纹图谱；双波长融合；超信息特征
Abstract：ObjectiveTo explore the HPLC-FPS of water extract
of Fructus Gardeniae by dual-wavelength fusing method. MethodsThe chromatographic fingerprints were obtained by injecting the sample solution each time on a CenturySIL C18 BDS column (20 cm×4.6 mm，5 μm) with the gradient elution solvent system composed of 1% acetate acid -water and 1% acetate acid -acetonitrile. The flow rate was 1.0ml/min, the column temperature was maintained at (30.00±0.15)℃and the DAD detector was used. ResultsThe HPLC-FPS of water extract of Fructus Gardeniae was established with dual-wavelength fusing method, acquired 41 common peaks by taking the peak of geniposide as referential peak. The fingerprints were comprehensively evaluated by “The digitized evaluation system of the Traditional Chinese Medicine fingerprint with the super-information characteristics”and the results were analyzed and compared with that of the fingerprints obtained under 265 nm. ConclusionThe dual-wavelength fusing method can effectively control the quality of Fructus Gardeniae and overcome the low information of mono-wavelength detection. It offers guarantee for the quality control of Fructus Gardeniae and provides a new method for thoroughly and authentically revealing the characteristics of TCM.
Key words：Fructus Gardeniae; Dual-wavelength fusing method; High performance liquid chromatography;Fingerprints;
Super-information characteristic
栀子为茜草科植物栀子Gardenia jasminoides Ellis的干燥成熟果实，其味苦、寒，归心、肺、三焦经，具有泻火除烦、清热利尿、凉血解毒之功效。

其主要化学成分有环烯醚萜苷类(如栀子苷)、有机酸类(如绿原酸)、色素(如藏红花素)，此外还有挥发性成分及多糖等［1］。

文献中有对栀子进行指纹图谱研究的报道［2～4］，但由于栀子中环烯醚萜苷类、有机酸酯类、西红花苷类等成分的最大吸收波长不一致，建立单一波长下的HPLC指纹图谱难以对栀子进行整体表达和全面评价。

曾有人应用融合方法对指纹图谱进行研究，但未能全面反映其信息［5～6］。

本文运用二极管阵列检测器采集了2个特征吸收波长下的指纹图谱，用“中药色谱指纹图谱超信息特征数字化评价系统”软件［7］建立了栀子水提取液254 nm和326 nm的双波长融合HPLC指纹图谱，并对其进行了全面评价，将其与265 nm 波长下指纹图谱进行对比，证明双波长融合指纹图谱优于单波长指纹图谱，符合建立中药指纹图谱的信息最大化原则。

1 仪器和试药
Agilent 1100 型液相色谱仪（配有二极管阵列检测器、低压四元梯度泵、在线脱气装置、自动进样器），Chem Station工作站（Agilent科技有限公司）。

KQ-50B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），旋转蒸发仪RE52（上海亚荣生化仪器厂），Sarturius-BS110S 分析天平（北京赛多利斯天平有限公司）。

绿原酸、
栀子苷（中国药品生物制品检定所），乙腈（色谱纯，山东禹王实业有限公司），冰醋酸（色谱纯，天津市科密欧化学试剂开发中心），其它试剂均为分析纯，所用水为去离子水。

10批栀子药材产自河南唐河县S1，贵州铜仁S2，安徽池州东至县S3，河南桐柏县S4，云南威信县S5，云南省红河哈尼族彝族自治州S6，浙江五凤乡S7，四川达县S8，江西金溪县S9，广西鹿寨县S10，经沈阳药科大学孙启时教授鉴定均为茜草科植物栀子Gardenia jasminoides Ellis的干燥成熟果实。

2 方法与结果
2.1 样品供试液制备栀子于60℃干燥40 min，粉碎后取约2.5 g，精密称定，加水50 ml，回流提取2 h，滤过，残渣加水30 ml，继续回流2 h，合并两次滤液，减压浓缩至20 ml，加乙醇至80%(V/V)，冷处避光放置、醇沉24 h，滤除沉淀，减压回收乙醇至无醇味，残液再用水定容至25 ml，摇匀，作供试液。

2.2 对照品溶液制备精密称取栀子苷对照品5.0 mg，置25 ml 量瓶中，以甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，得浓度为200 μg·ml-1栀子苷对照品溶液。

同法配制400μg·ml-1绿原酸对照品溶液。

2.3 色谱条件Century SIL C18 BDS柱(20 cm×4.6 mm，5 μm)，流动相：A=水（含1%醋酸），B=乙腈（含1%醋酸），低压线性梯度程序：0～9 min，5%～5%B；9～22 min，5%～10%B；22～30 min，10%～12.5%B；30～45 min，12.5%～30%B；45～50 min，30%～36%B；50～75 min，36%～86%B；流速1.0 ml·min-1，柱
温（30±0.15）℃，进样量5 μl。

2.4 双波长融合指纹图谱的获得将栀子供试液进样5 μl，同时采集多个波长下的信号并记录3D光谱图，结果在280 nm和350 nm 波长下的色谱图中色谱峰较少且信号很弱；265 nm波长下色谱峰较多且基线较平；254 nm波长下0～30 min色谱峰较多且信号强，但基线不够理想；326 nm波长下30～60 min色谱峰较多且信号强，但0～30 min色谱峰很少。

为使指纹图谱中信息达到最大化，用“中药色谱指纹图谱超信息特征数字化评价系统”软件将254 nm（0～30 min）和326 nm（30～60 min）下的图谱进行融合处理，即得到栀子双波长融合HPLC指纹图谱。

2.5 指纹图谱方法学考察
2.5.1 系统适用性实验将栀子苷对照品溶液和样品供试液分别进样5 μl，对比保留时间及在线紫外光谱图可知栀子苷峰在2
3.6 min 左右。

由于栀子苷峰与相邻峰分离很好，在测定时比较稳定，峰面积较大，因此选作参照物峰。

在此系统条件下，以栀子苷计算色谱柱的理论板数应不低于160 000。

2.5.2 精密度实验精密吸取S1号栀子样品供试液5 μl，连续进样5次，记录色谱图，经处理得双波长融合HPLC指纹图谱。

以栀子苷峰为参照物峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。

结果显示，样品供试液分析结果稳定，各共有峰相对保留时间RSD均小于1.0%；相对峰面积的RSD其余均小于4.0%，表明检测系统的进样精密度良好。

2.5.3 溶液稳定性实验取S1号栀子样品，按“2.1”项制备供试液，分别在制备样品后的0，4，8，12和16 h进样测定，记录色谱图，经处理得双波长融合指纹图谱。

以栀子苷峰为参照物峰，计算各峰的相对保留时间的RSD均小于1.0%；相对峰面积的RSD均小于5.0%，表明样品在16 h内基本稳定。

2.5.4 方法重复性实验取S1号栀子样品，按“2.1”项制备供试液5份，精密吸取5 μl在HPLC仪上进样并检测，记录色谱图，经处理得双波长融合指纹图谱。

计算各峰的相对保留时间的RSD均小于
1.0%；相对峰面积的RSD均小于4.0%，表明方法重复性良好。

2.6 栀子双波长融合HPLC指纹图谱建立
2.6.1 共有指纹峰的标定对10个不同产地的栀子进行指纹图谱检测，记录其色谱图，经处理得双波长融合指纹图谱。

比较分析并以共有率100%计，确定共有峰为41个，见图1。

10批供试品HPLC 图谱各共有峰相对保留时间的RSD除2号峰（RSD = 4.84%），其余均小于3.0%，栀子苷峰（18号）与相邻峰分离较好，响应值较大，因此选作参照物峰。

参照峰标号为18（S），其他共有峰依次为1，2，3， (41)
2.6.2 对照指纹图谱的建立及相似度评价将10批栀子色谱图原始信号导入孙国祥等［7］开发的“中药色谱指纹图谱超信息特征数字化评价系统”软件生成对照指纹图谱（平均值法）数据见表1，标号图见图2。

表1 栀子双波长融合对照HPLC-FP峰信息（略）
2.6.3 10批栀子等量混合提取后检测的HPLC指纹图
谱特征精密量取混批供试液5 μl注入HPLC进行检测，记录色谱图，并用“中药指纹图谱超信息特征数字化评价系统”软件计算其与对照指纹图谱的相似度为0.982，其共有峰面积之和与对照指纹图谱共有峰面积之和的比为92.1%。

10批栀子等量混批产生的指纹图谱与计算生成的对照指纹图谱相似度很好，说明计算生成的栀子对照指纹图谱可靠。

2.7 栀子双波长融合HPLC指纹图谱超信息特征数字化评价栀子双波长融合HPLC指纹图谱超信息特征数字化评价结果见表2。

①描述分离程度参数m、β及R分别为38～40，0.95～1.0及4.2～5.6，说明分离状况较好，各峰之间基本达基线分离。

②三强峰A1 + A2 + A3＞50%说明三强峰面积较大。

③均化系数γ= 0.344～0.415和峰面积比率δ= 0.364～0.501，表明信号平均化较差；分离度均化系数τ= 0.780～0.825，表明峰间等距性良好。

④总积分面积和∑Ai = 15923～35561、平均峰面积A_avg = 388.4～867.4和几何平均峰面积A_geo = 175.4～374.8及平均峰高H= 3
3.3～72.7都表明栀子指纹信号较强。

⑤指纹峰平均峰宽W_avg = 0.20～0.28和最强峰柱效N = 136735～188951，说明柱效较高。

⑥指纹图谱指数F和指纹图谱信息量指数I是反映指纹信号强度、信号均化性、分离程度的综合指数，F= 31.9～39.7和I = 16.2～18.5均表明栀子双波长融合指纹图谱绝对指数处于中等水平；指纹图谱相对指数Fr = 63.6～79.3和相对信息量指数Ir = 32.3～36.9都大于F和I。

Fr(t)和Ir(t)是对分析时间进行校正的指数值，二者均接近于原来F和I值，说明时间效率
不突出；Fr(q)和Ir(q)是对进样量进行校正的指数值，二者均远高于原来F和I值，说明样品所含化学信息量很高。

考虑到储藏和加工等因素的影响下，F、Fr、I和Ir应分别不低于31，63，16和32。

⑦10批栀子与对照指纹图谱的定性相似度SF均大于0.97，说明这10个产地栀子药材在化学成分分布上与对照指纹图谱相似性均很好，其定性相似度均合格。

比率定性相似度S’F在数值上均低于S’F，原因是它将各峰等权计算，排除了18号峰所起的绝对作用。

S1，S3，S6，S8，S10栀子的C%和P%值均在80%～120%之间，与对照指纹图谱比较，其定量相似度均合格。

但其它产地栀子与对照指纹图谱的含量差异很大，S4，S5，S9的C%分别为59.9%，73.8%和70.6%，含量偏低，而S2，S7的C%分别为143.3%和145.6%，含量偏高，提示使用这些药材时，应考虑混批勾兑，以便使之符合要求。

比如用S5，S7投料生产制剂时应考虑按1∶1混批，保证C%在80%～120%之间。

表2 栀子双波长融合HPLC指纹图谱超信息特征数字化评价结果（略）
2.8 栀子265 nm HPLC指纹图谱的建立及超信息特征数字化评价以“2.3”项下色谱条件建立栀子265 nm HPLC指纹图谱，经指纹图谱方法学考察，各项指标均符合要求。

对10个不同产地的栀子进行指纹图谱检测，记录其色谱图，见图3。

比较分析并以共有率100%计，确定共有峰为35个。

将10批栀子色谱图原始信号导入“中药色谱指纹图谱超信息特征数字化评价系统”软件生成对照指纹图谱（平均值法）,标号图见图4。

由软件计算得栀子265 nm HPLC指纹
图谱超信息特征数字化评价结果见表3。

表3 栀子265 nm HPLC指纹图谱超信息特征数字化评价结果（略）
2.9 栀子双波长融合与265 nm HPLC指纹图谱评价结果比较将10批栀子的定性和定量相似度进行比较，见表4。

表4 定性定量相似度比较（略）
2.9.1 双波长融合指纹图谱除S3 的S’F＜0.90外，10批栀子融合谱与对照指纹图谱的相似度SF和S’F均≥0.90，其定性相似度均合格，说明样品化学成分分布与对照指纹图谱十分相似。

10批栀子C%在59.9%～145.6%，P%在65.5%～147.1%，定量相似度S1，S3，S6，S8，S10合格。

S4，S5，S9含量明显偏低，S2，S7含量明显偏高。

说明10批样品化学成分分布尽管相同，但含量与对照指纹图谱差距较大。

2.9.2 265 nm指纹图谱除S3 的SF’＜0.90外，10批栀子与对照指纹图谱的相似度SF和S’F均≥0.90，其定性相似度均合格，说明样品化学成分分布与对照指纹图谱十分相似。

10批栀子C%在60.6%～142.2%，P%在64.9%～136.1%，定量相似度S1，S3，S6，S8，S9，S10合格，S4、S5含量明显偏低，S2，S7含量明显偏高。

说明10批样品化学成分分布尽管相同，但含量与对照指纹图谱差距较大。

以上分析显示，除个别数据外，大部分数据都很相近，双波长融合与265 nm HPLC指纹图谱对不同产地栀子定性定量评价的
结论一致。

选择栀子双波长融合指纹图谱与265 nm指纹图谱超信息特征数字化评价结果中代表性指标进行比较，见表5（表中数据为二者对照指纹图谱数据）。

表5 栀子双波长融合谱与265 nm HPLC指纹图谱评价结果比较（略）
双波长融合指纹图谱的信号强度（A_geo，A_avg，H_avg）是265 nm指纹图谱的2倍，总积分面积和∑Ai是265 nm的2.9倍；双波长融合指纹图谱的信号均化性（γ，δ）略低于265 nm；双波长融合指纹图谱的指纹峰色谱空间利用率η和分离度均化系数τ高于265 nm双波长融合指纹图谱的色谱指纹图谱指数（F和Fr）和色谱指纹图谱信息量指数（I和Ir）都高于265 nm指纹图谱。

通过以上分析可知，双波长融合指纹图谱在信号强度、分离度均化性、信息量丰富程度等方面均优于265 nm指纹图谱，克服了单波长检测时信息量低的缺点，能更加全面、真实地揭示中药材的内在特征。

3 结论
本实验建立了栀子双波长融合HPLC指纹图谱。

用“中药色谱指纹图谱超信息特征数字化评价系统”软件对其进行评价，与同条件下265 nm指纹图谱相比，二者对不同产地栀子定性定量相似度评
价的结论基本一致，但双波长融合指纹图谱在信号大小、分离度均化性、信息量丰富程度等方面均优于265 nm指纹图谱，双波长融合谱实现了建立中药指纹图谱的信息最大化原则，为全面真实准确地揭示中药材的内在特征提供了一种新方法，具有重要的应用价值。

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