非小细胞肺癌EGFR酪氨酸激酶抑制剂的耐药机制及逆转

【摘要】晚期非小细胞肺癌（non-small-cell lung carcinoma，NSCLC）的治疗以含铂双药联合化疗为标准治疗方案，多项研究表明，化疗药物对于NSCLC的疗效已经进入平台期，因此，寻求新的治疗方式已迫在眉睫。

表皮生长因子受体（EGFR）在40% 80%的NSCLC中过表达，通过干预EGFR酪氨酸激酶信号转导已成为治疗NSCLC的主要方式。

临床应用的EGFR抑制剂主要有EGFR单克隆抗体（mon-oclonal antibody，MAb）及特异性小分子酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor，TKI）。

目前已证实EGFR-TKI的疗效肯定，但其原发性及继发性耐药是一个不容忽视的问题，且耐药机制复杂。

文章对EGFR-TKI在临床中的应用，EGFR突变与TKI敏感性的关系，EGFR-TKI的耐药机制及逆转耐药的方法进行综述。

【关键词】非小细胞肺癌；EGFR；EGFR酪氨酸激酶抑制剂；耐药；耐药逆转
doi：10．3969/j．issn．1674－4136．2012．03．012
文章编号：1674P4136（2012）03－0164－05
表皮生长因子受体（EGFR）信号通路参与控制细胞的存活、增殖、血管生成、细胞迁移、细胞侵袭及转移等过程［1］，因此通过干预EGFR酪氨酸激酶信号转导已成为近年来肿瘤治疗的研究热点。

EGFR 特异性小分子酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase in-hibitor，TKI）吉非替尼和厄洛替尼是治疗非小细胞肺癌（non-small-cell lung carcinoma，NSCLC）的小分子靶向药物。

2004年，多个权威期刊发表了关于EGFR突变与TKI药物敏感性关系的研究，发现EGFR突变的患者对TKI药物有很好的反应性［2-3］，特别是具有19外显子密码子746 750的缺失突变，21外显子密码子858替代突变（L858）的患者对TKI高度敏感。

尽管如此，原发性及继发性耐药仍是亟待解决的问题。

到目前为止，很多关于耐药的机制被报道，如EGFR基因20外显子的插入突变及KRAS基因突变与原发性耐药有关；EGFR基因的二次突变，MET基因的扩增以及HGF基因的过表达与继发性耐药有关等。

本文就EGFR靶向治疗药物的临床应用，耐药机制及相关解决方法进行综述。

1EGFR-TKI在NSCLC临床治疗中的应用
EGFR-TKI通过与细胞内酪氨酸激酶结构域上ATP位点竞争性结合，可逆性、选择性抑制与EGFR 相关的酪氨酸激酶活性及细胞内磷酸化过程，进而抑制EGFR下游的信号转导，从而阻断EGFR诱导的体外肿瘤细胞的生长，加速细胞凋亡、拮抗血管生成、抑制肿瘤转移、阻断肿瘤生长。

1．1吉非替尼
吉非替尼是最早用于治疗NSCLC的靶向药物之一，已有多项国际多中心临床研究证实吉非替尼治疗肺腺癌有效。

IPASS研究是在东亚，对非吸烟或很少吸烟的患者进行吉非替尼与卡铂+紫杉醇联合化疗的对照实验，结果显示在所有患者中吉非替尼组比卡铂－紫杉醇组有更长的无疾病进展
（PFS），在EGFR突变的患者中吉非替尼组的PFS 更是明显长于联合化疗组（9．5个月vs．6．6个月）［4］。

IDEAL-1及IDEAL-2为两项多中心Ⅱ期临床试验，结果也均显示吉非替尼对复治的进展期NSCLC患者具有令人鼓舞的抗肿瘤活性和耐受性［5-6］。

但基于吉非替尼与细胞毒药物化疗的协同作用研究结果则不满意，一项Ⅲ期临床试验IN-TACT-1，在GP方案中加入吉非替尼却未显示出任何获益。

另一项Ⅲ期临床研究INTACT-2则对吉非替尼联合TC作为晚期NSCLC一线治疗方案作了评价，显示在化疗的基础上加用吉非替尼，OS、RR及无病生存期（DFS）也无明显改善［7］。

值得注意的是，在INTACT试验中的312例患者中有32例（10%）被检测出有EGFR突变，而依据EGFR基因型判断对吉非替尼联合化疗的反应虽无明显的统计学意义，但EGFR突变的NSCLC患者应用吉非替尼后生存率却显著提高。

1．2厄洛替尼
厄洛替尼是一种可逆的ATP竞争性EGFR-TKI，通过抑制EGFR自身磷酸化而抑制下游信号传导与细胞增殖。

Ⅲ期临床研究BR．21试验结果显示，与安慰剂相比，口服厄罗替尼150mg/d可显著延长晚期NSCLC患者生存期，改善生活质量［8］。

在2009年ASCO年会上，来自西班牙的数据也提示厄罗替尼单药治疗晚期EGFR突变的NSCLC患者，中位疾病进展时间（TTP）达到14个月，中位生存期为27个月，明显优于标准一线化疗方案。

1．3其他
不可逆的EGFR抑制剂包括BIBW2992、BMS-690514、PF-00299804和EKB-569等，它们的疗效尚待评估［9］。

还有针对多靶点信号通路的药物，如ZD6474（vandetanib）和BMS-690514，目前也都处于临床试验阶段。

2EGFR突变与TKI敏感性的关系
EGFR的激活性突变集中在四个密码子（18 21），分别为外显子18的单碱基替代、外显子19的缺失、外显子20的插入/重迭及外显子21的单碱基替代L858R的点突变。

其中19外显子的缺失突变和21外显子的点突变占所有突变的90%［10-11］。

在所有突变中，G719C（外显子18）、E746-A750（外显子19）、R776C（外显子20）及L858R（外显子21）的突变与TKI敏感性有关。

上述突变阳性者对EGFR-TKI的有效率为50% 80%，而野生型患者的有效率仅为10% 15%。

相关研究发现，EGFR突变在亚洲人、女性、非吸烟及腺癌患者中常见，而突变患者对吉非替尼和厄洛替尼高度敏感，但TKI并非对所有EGFR基因突变的肺癌患者有效，一些基因突变患者并不能从TKI治疗中获益，同时约18%的EGFR未突变的患者却对TKI存在部分反应性［12］。

3EGFR-TKI的耐药机制
3．1原发性耐药机制
原发性耐药是指首次使用TKI治疗即产生的耐药，约有60%的肺癌患者为TKI原发性耐药。

目前认为，KRAS突变和EGFR外显子20的插入突变与TKI的原发性耐药相关［13-14］。

Pao等［15］共收集了60例首次TKI单药化疗的肺腺癌患者，有38例对TKI不敏感，其中9例存在KRAS的基因突变；而在客观缓解的21例患者中均无KRAS突变。

由此推断KRAS基因突变与肺腺癌患者对TKI的原发耐药密切相关。

Eberhand等［16］也发现具有KRAS突变的患者不仅没有从厄洛替尼与化疗联合应用中获益，而且与单纯接受化疗的患者相比预后更差。

需要注意的是，KRAS突变与EGFR突变是不共存的，因此对没有EGFR突变的患者是否选择TKI治疗主要应参考KRAS基因的突变情况。

3．2获得性耐药机制
获得性耐药的确切机制目前仍不清楚。

目前几个潜在的假说有：二次突变学说，Met受体酪氨酸激酶基因扩增学说及其他受体酪氨酸激酶的过度表达学说［17-18］。

3．2．1二次突变学说T790M的二次突变最普遍，在约50%的TKI耐药患者中出现，其他位点的二次突变相对少见。

（1）T790M突变：EGFR基因外显子20在TKI治疗过程中出现二次突变，导致EGFR790位点上的苏氨酸（threonine）被甲硫氨酸（methionine）取代，结果在该位点上引入了一条较大的氨基酸侧链，构成空间位阻，因此阻止TKI和EGFR-TK催化域中的Mg-ATP位点的竞争性结合，而ATP与酪氨酸激酶的结合未受影响，激酶继续得以磷酸化［19］。

Bell等［20］对一个肺癌家系的研究提示T790M并非致癌性突变，其在早期可能以微小克隆形式存在于癌组织中，随着敏感克隆被TKI清除通过自然选择的作用而被保留下来并进一步扩增凸显，在肿瘤发展的继承阶段起重要作用。

为进一步证实T790M并非原发突变，Toyooka等［21］的研究证实在未接受TKI治疗的患者中仅有0．5%可检测出
T790M突变。

Onitsuka等［22］也进行过类似的研究，发现在10个吉非替尼继发耐药的患者中有7个检测出T790M突变。

（2）非T790M突变：与T790M 突变相类似的耐药突变还有D761Y、L858R、L747S、E884K及G796A等突变，他们的总发生率低于5%。

第一个被发现的非T790M突变的是D761Y，通常与L858R突变并存的，两位点同时突变与L858R突变相比更容易对吉非替尼耐药，但与T790M突变相比，耐药可能性要小很多［23］。

L747S、L858R同时突变也比单纯L858突变在体外对吉非替尼和厄洛替尼更容易耐药。

一项关于L858R、L747S和L858R、D761Y突变的体外临床试验显示当吉非替尼和厄洛替尼达到1uM时可以阻止这些突变，说明可以通过TKI的剂量转换即能解决对吉非替尼的耐药［24］。

Choong等［25］报道了1例从未吸烟的70岁肺腺癌的日裔女性，接受EGFR-TKIs治疗失败后检测发现了E884K和L858R体细胞突变，提示这两种突变类型可能参与TKI耐药的发生。

Uramoto等［26］报道EGFR外显子20的G796A突变也可能参与了吉非替尼耐药的发生。

3．2．2c-MET扩增学说2007年，Dana-Farber肿瘤研究中心报道MET基因的扩增与吉非替尼的获得性耐药有关。

研究显示，MET是肝细胞生长因子（HGF）的受体，编码HGF酪氨酸激酶受体的跨膜区，与肿瘤的侵袭、转移和扩增有关。

MET基因的扩增在未治疗的NSCLC中很少见，但是在对TKI获得性耐药的细胞中发现MET基因的扩增，从而提示其与另一种新的耐药机制有关［27］。

Engelman等［18］在18例已被吉非替尼诱导耐药的肺癌细胞株中检测出4例MET基因扩增，结果显示MET基因扩增可诱导HER3（ErbB3）磷酸化，使PI3K/Akt通路持续活化，从而导致吉非替尼继发耐药的发生。

3．2．3肝细胞生长因子过表达学说2008年，日本的一家研究机构报道肝细胞生长因子（HGF）的过表达与EGFR-TKI的耐药有关。

HGF通过MET 的磷酸化降低了PI3K/AKT通路的恢复。

尽管MET 基因扩增激活了与ErbB3有关的下游通路，HGF通过MET降低了下游通路的活性，这种激活不依赖ErbB3或者EGFR。

研究发现HGF的过表达不仅存在于没有T790M突变或MET基因扩增的耐药的肿瘤中，还在没有EGFR敏感性突变的原发性耐药肿瘤中存在［28］。

Turke等［29］等通过检测27例肿瘤组织，通过对比用药前与用药后的肿瘤组织，发现其中有16例在经过TKI治疗后出现HGF的显著增高。

Guix等［30］还发现HGF通过选择性扩增MET基因过表达的克隆从而发挥耐药作用。

尽管目前在获得性耐药的肿瘤中HGF出现的频率尚不清楚，但是HGF与T790M突变共存的现象比较多。

Yamada 等［31］报道HGF的过表达不仅与可逆性EGFR-TKI 耐药有关，还与不可逆性EGFR-TKI耐药有关。

3．2．4其他学说由于ErbB3介导的P13K信号通路的持续激活和TKI耐药相关，反之猜测P13K 信号通路抑制成分的缺失在耐药发生中举足轻重；此外，通过mTOR-IGFIR起作用的信号通路也会使EGFR靶向治疗有效的病例复发。

由此，学者还提出了其他的耐药机制，如细胞的程序性死亡，上皮－间质转化及10号染色体q23D的缺失等。

4耐药逆转的方法
4．1不可逆性EGFR-TKI
吉非替尼和厄洛替尼都是可逆性EGFR-TKI，也被称为第一代EGFR-TKI，目前在研究中的第二代EGFR-TKI大多为不可逆的EGFR-TKI。

通过共价结合于EGFR催化域ATP结合位点边缘的cys-797，从而使药物浓度大幅升高并提供持续的封锁效应，因此能进一步增强对肿瘤细胞的抑制。

目前进入临床试验的有同时抑制EGFR及HER2的双重抑制剂HKI-272［31］及BIBW2992［32］，以及同时抑制EGFR，HER2和HER4的三重抑制剂PF-00299804［33］。

体外研究表明HKI-272对含有双突变（对TKI敏感的突变如EGFR外显子19缺失突变和外显子21的L858R点突变及T790M突变）的肺癌细胞系有效，但不能完全阻断T790M突变的信号传导。

临床前试验发现BIBW2992对有继发性耐药突变T790M的肿瘤细胞有活性，尽管不可逆性EGFR-TKI能有效抑制含有T790M突变的肿瘤细胞，但是含有EGFR T790M扩增的克隆无论是在体内还是体外都迅速融合，从而导致对不可逆性EGFR-TKI耐药。

4．2MET抑制剂及HGF抑制剂
一项临床前研究显示了MET及HGF抑制剂的有效性，抑制MET基因扩增的抑制剂PHA-665752及抑制HGF过表达的抑制剂PF2341066都被证实有临床疗效［34］。

MET基因的扩增与HGF的过表达通常是与T790M突变共存的，因此，要解决耐药问题，联合使用不可逆性EGFR-TKI及MET抑制剂正在临床研究中。

4．3p53抑制剂
大多对吉非替尼有效的患者存在EGFR突变，但并不是所有EGFR突变患者对EGFR-TKI有效，而一些没有EGFR突变的患者又能获得疗效，这表明还存在决定患者对吉非替尼敏感性的其他因素。

肿瘤抑制基因p53能通过调节NSCLC中的Fas促进吉非替尼诱导的生长抑制和凋亡，p53的突变常与药物耐药相关。

Jin等［35］将吉非替尼用于人NSCLC株NCI-H1299和A549，这两种细胞株均没有EGFR-TK突变，研究发现NCI-H1299（存在p53无效基因型）比A549细胞株（存在野生型p53）对吉非替尼更为耐药（NCI-H1299IC50为40μmol/L，A549IC
50
为5μmol/L）。

在稳定的H1299细胞株中，有四环素诱导的p53表达，被诱导的p53通过上调Fas和恢复半胱氨酸天冬氨酸酶（caspase）活性，能促进吉非替尼诱导的生长抑制和凋亡。

相反，同等条件下使用反义寡聚核苷酸的p53抑制剂，在A549细胞株中能使吉非替尼诱导的凋亡明显降低，同时Fas下调。

因此，p53可能通过调节NSCLC中的Fas表达以确定肿瘤细胞对吉非替尼的敏感性。

综上所述，分子靶向治疗对肿瘤治疗具有划时代的意义，从基因学角度寻找合适的患者，能达到最好的治疗效果。

耐药现象不可避免地发生为靶向治疗进一步的应用带来问题，对于耐药机制的研究可以帮助人们寻找到能够预测疗效和指导治疗策略的分子标志物，使得靶向药物的治疗效果进一步提高。

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［收稿日期：2012-02-20］［本文编辑：刘嘉］。