中山大学基因工程原理教程提纲

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来源: 大肠杆菌(BAP) 或小牛肠(CIP)
活性: 催化核酸分子脱掉 5’ 磷酸基团
应用: 防止质粒的自我环化.
五、核酸外切酶---单链核酸外切酶和双链核酸外切酶
六、单链核酸内切酶---S1 核酸酶
七、文献导读
第二节 基因克隆的载体---见《基因工程原理》第四章
结构域的序列
1） 启动子：(见表)，皆含有可被 RNA 聚合酶 II 识别的较强的启动子。
组成型启动子，如 ADH1;
诱导型启动子，如 GAL10.
2） 先导序列：ATG
3) 转录终止子：3’ 端终止及多聚 A 形成
4) 有用的蛋白质结构域的序列：
信号肽序列---可引导表达产物分泌到细胞外；
核定位序列---可引导表达产物转运到细胞核中；
第二章 基因操作的技术原理
第一节 基因工程操作中常用的工具酶---见《基因工程原理》第 121-173 页
一、限制性内切酶---II 型
二、连接酶：见《基因工程原理》第 137-153 页
催化两条 DNA 链之间形成磷酸二酯键。
（1）DNA 连接酶
来源：大肠杆菌，一般用于粘端连接
（2）T4 DNA 连接酶：
应用：缺刻平移制备 DNA 杂交探针（图）
(2) Klenow 大片段酶:
来源： 来自 DNA 聚合酶 I 的一个片段；
活性： 没有 5’---3’ 外切酶活性，有 5’---3 ’ 聚合酶 和 3’—5’ 外切酶活性；
应用： 末端补平；具有 3’凹端的 DNA 片段的放射性末端标记等(图).
(3) T4 DNA 聚合酶：
粘端连接（图），平末端连接（图），平末端加多聚尾巴（图），衔接物连接（图），
人工接头（图）
三、DNA 聚合酶---性质和应用：
(1) E.coli DNA 聚合酶 I：(图)
活性：5’---3 ’ 聚合, 5’---3’ 和 3’—5’ 外切酶； 反应条件: dNTP, Mg2+ , 带有 3’-基团的引物链， DNA 模板
从功能上来分（图），有
插入型载体：只具有一个可供外源 DNA 插入的克隆位点；
应用：插入片段较小（~10kb），用于 cDNA 及 DNA 小片段克隆；
替换型载体：具有一段可供外源 DNA 插入的克隆位点，~15-23kb
其它衍生质粒：粘粒载体（cosmid vector）见《基因工程原理》第 272--280 页
YCp（着丝粒质粒）：稳定，拷贝数 1~2/细胞，丢失率低（1%/代）。
YEp （游离型质粒）：含 2µm 质粒的序列，自主复制，稳定，拷贝数一般 20~50/细胞， 转化效率高（104~105 转化子/µg DNA），常用于高水平表达外源
基因。
YLp （线性质粒）： 末端含有类似于端粒的重复序列，从而可以进行复制，不稳定，丢 失率约 10-2~10-3。
来源：大肠杆菌 T4 噬菌体，可用于粘端及平端连接，活性高。
（3）连接反应的条件:
a)常规连接： 4-16℃，数小时至过夜
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一、 细菌质粒载体
概念：细菌染色体外小型的共价闭合环状双链的 DNA 分子。
构型：超螺旋型，即共价闭合环状；
开环结构，双链中有一条有一至数个缺口；
线型，DNA 发生双链断裂。
质粒的类型：接合型， 非接合型
质粒的复制类型：严紧型复制控制，低拷贝数，拷贝数只有 1~3；
松弛型复制控制，高拷贝数，拷贝数有 10~60。
----DNA 的纯化
例：酵母染色体的快速分离---见《新编分子生物学实验指南》第 523 页
细菌基因组的快速分离---见《新编分子生物学实验指南》第 39 页
（二）基因组 DNA 的片段化（见《基因工程原理》第 308-309 页）
机械切割法（见《基因工程原理》第 308 页）
限制性内切酶法---部分酶切（见《基因工程原理》第 137 页）
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本课程授课安排
Genetic Engineering: A Short Course
导言 基因工程的定义---见《基因工程原理》第 43 页 基因工程的主要步骤----见《基因工程原理》第 44 页 分离目的基因---目的基因与载体的体外重组----转入受体细胞并增殖---目的重组子的筛选--提取目的基因---目的基因与表达载体连接----表达----表达产物的获得 基因工程发展大事记------见《基因工程原理》第 40-41 页表 基因工程研究的意义 1. 基因工程是生物工程（基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程和生化工程）的主要组
常用的质粒载体及其特点：
（一）质粒（基因工程）载体必须具有的性质：
a) 自我复制；
b) 易于从寄主细胞中分离并进行纯化；
c) 具有适当的限制性内切酶的酶切位点（单一位点）；
d) 具有选择标志（标记基因）；
e) 适当的大小（数 kb 到十几 kb）。
（二）复制起始位点，一般只含有一个；
（三）常用选择性标记：一般以抗性基因为标记，如抗氨苄青霉素等；
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五、 真核细胞用的载体
六、 酵母质粒载体---见(1)《新编分子生物学实验指南》第 13 章
(2) 贺淹才编著 《简明基因工程原理》p.107-111
酿酒酵母是一种模式生物
(一) 酵母菌的克隆载体（图）
根据载体在酵母细胞中复制方式的不同，酵母菌载体可分成 5 种基本类型：
前 4 种为穿梭质粒， YLp 只能在酵母细胞中复制。
（二）酵母菌的表达载体（如 pGBKT7）
主要由以下几部分组成：
选择性标记 如一些野生型基因 URA3, LEU2, HIS3, 等。
复制子
大多来自酵母内源性质粒 2µm 的复制子（复制起始位点），10~40 拷贝/细
胞。
表达盒 包括酵母启动子，多克隆位点，转录起始序列，转录终止子，编码有用的蛋白质
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----破碎细胞（物理或化学方法）
----将核酸与蛋白质分开
----将 RNA 与 DNA 分开
(6) Taq DNA 聚合酶:
来源: 水生嗜热菌
活性: 聚合活性（几千 kb）
应用: PCR 反应; DNA 测序
四、修饰酶：
(1) 末端脱氧核苷酸转移酶:
来源: 小牛胸腺
活性: 催化 5’ 脱氧核苷三磷酸进行 5’-3’ 方向的聚合作用
应用: 同聚物加尾进行 DNA 片段的克隆
(2) T4 多核苷酸激酶 :
来源: 感染了 T4 噬菌体的大肠杆菌
活性: 催化γ-磷酸从 ATP 分子转移给 RNA 或 DNA 分子的 5’-OH 末端
应用: DNA 探针 5’末端标记
(3) 碱性磷酸酶---BAP and CIP
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标签蛋白序列---有利于进行免疫检测和纯化，如 c-Myc。
七、人Hale Waihona Puke Baidu染色体载体---以 pYAC 为例（参见《基因工程原理》第 348-349 页
第三节 目的基因的制取与克隆---见《基因工程原理》第 305-339 页
一、各种生物基因组的大小---见《基因工程原理》第 38 页 二、基因组 DNA 的片段化
（一） DNA 的提取： DNA 提取总的原则：
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RNA-DNA 杂交分子为底物的 5’-3’ DNA 外切酶活性
应用：以 RNA 为模板合成 cDNA。
(5) T7 DNA 聚合酶:
来源：感染了 T7 噬菌体的大肠杆菌
活性：由两个亚基组成，聚合活性（几千 kb）
应用：（1）DNA 合成； （2）DNA 3’ 末端标记; (3) 末端补平
------修饰的 T7 DNA 的聚合酶:
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b)快速连接： 室温， 5 分钟
（4）DNA 连接的 5 种类型：
来源：T4 噬菌体感染的大肠杆菌
活性：5’---3 ’ 聚合酶 和 3’—5’ 外切酶活性；
应用：取代合成法标记 DNA 片段(图)
(4) 逆转录酶：依赖于 RNA 的 DNA 聚合酶
来源：鸟类骨髓母细胞瘤病毒（AMV）
活性：由α和β两条多肽链组成，前者具有逆转录酶活性和 RNaseH 活性，后者具有以
YIp（整合型质粒）: 通过同源重组整合到染色体基因组中，转化效率低（1~10 转化子/µg
DNA, 若将质粒线性化后再转化酵母菌，则可提高转化效率 10~1000
倍。
YRp（自主复制质粒）：含 ARS 序列，转化效率高（103~104 转化子/µg DNA），质粒易
丢失，仅约 5%~10%细胞含有质粒，但质粒拷贝数高（~100）。
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（四）高拷贝数的质粒载体：pUC 质粒载体（图）：结构，优点
（五）表达型的质粒载体（图）
（六）能在体外转录克隆基因的载体：pGEM-3Z（图）
（七）穿梭质粒（见酵母质粒载体）
（八）质粒的稳定性问题（略，自学）
二、λ 噬菌体载体 λ 噬菌体：大肠杆菌双链 DNA 噬菌体，线形或环状（图） 以 λ 噬菌体为基础构建载体：减少限制性内切酶酶切位点，去掉非必需片段
成部分（图） 2. 基因工程与生物医药 3. 基因工程与环境保护 4. 基因工程与疾病研究 5. 基因工程与基础生物学---基因组计划 6. 基因工程的安全性—第 44—46 页 7. 中国的基因工程 第一章 基因表达的调控（自学）
第一节 第二节
原核基因表达的调控 乳糖操纵子模型 色氨酸操纵子模型 真核基因表达的调控 转录水平的调控---最主要的调控方式 翻译水平的调控
三、 M13 噬菌体载体（图）
单链 DNA 噬菌体,
四、 噬菌粒（图）：质粒载体和单链嗜菌体载体结合而成。
pUC118/pUC119， pBluscript
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三、DNA 片段的分部分离
---超速离心法：蔗糖密度梯度离心，氯化铯密度梯度离心
---凝胶电泳法（见《基因工程原理》第 51 页）